Vergleichende Microarray-Analysen von humanem Periimplantitis- und Parodontitis-Gewebe in vivo

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F. vom Orde1, M. Rödiger2, N. Gersdorff2

Zielsetzung: Ziel der vorliegenden in-vivo-Studie war die Durchführung einer vergleichenden Genexpressionsanalyse von entzündetem periimplantären und parodontalen Gewebe, um mögliche Unterschiede dieser beiden Krankheitsentitäten auf molekularbiologischer Ebene aufzuzeigen. Die hier zusammengefassten Ergebnisse wurden in zwei Publikationen veröffentlicht [7, 17].

Materialien und Methoden: Unter Verwendung der Microarray-Technologie wurden die Genexpressionsmuster von entzündetem periimplantären Gewebe, entzündetem sowie gesundem parodontalen Gewebe untersucht und mittels Real-time(RT)-PCR verifiziert. Der Schwerpunkt lag hierbei auf Komponenten der extrazellulären Matrix sowie deren abbauender Enzyme.

Ergebnisse: Für die Gruppe der Kollagene konnte gezeigt werden, dass die nicht-fibrillären Kollagene (Typ IV, VI, VII und XVII) ein erhöhtes Expressionsmuster und die fibrillären Kollagene (Typ III und XI) ein verringertes Expressionsmuster im entzündeten periimplantären Gewebe im Vergleich zum entzündeten parodontalen Gewebe aufweisen. Bei den Enzymen wiesen Cathepsin B und C, MMP-1 und MMP-9 eine erhöhte Genexpression auf. Des Weiteren waren die MMP-Inhibitoren TIMP-1 und TIMP-3 signifikant erhöht.

Schlussfolgerungen: Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Studie, dass die Periimplantitis auf der molekularbiologischen Ebene klar von der Parodontitis abgrenzbar ist. Der Vergleich dieser beiden oralen Erkrankungen ist neben dem Erkenntnisgewinn über die Funktion krankheitsspezifischer Gene für Diagnose, Verlaufskontrolle und Prognose sowie für die Entwicklung neuer Periimplantitis-Therapien nutzbar.

Schlüsselwörter: Periimplantitis; Parodontitis; Microarray; Real-
time(RT)-PCR; Extrazelluläre Matrix

Hintergrund

In der modernen Zahnmedizin hat die orale Implantologie einen beachtlichen Stellenwert erlangt. Die klinische Langzeitprognose dentaler Implantate hängt von einer adäquaten Integration in die umgebenden Gewebe (Epithel, Bindegewebe und Knochen) ab.

An das periimplantäre Gewebe werden ähnliche Forderungen gestellt wie an das parodontale Gewebe: Stütz- und Verankerungsfunktion, Anpassungsfähigkeit der Gewebe gegenüber funktionellen Reizen und Schutzfunktion gegenüber Noxen der Mundhöhle. Im Gegensatz zu den Zähnen, die sich zusammen mit ihren Stützgeweben entwickeln, werden enossale Implantate in ein chirurgisch präpariertes Empfängerbett ausgereiften Gewebes inseriert (Abb. 1). Folglich sind die periimplantären Gewebe Resultat eines Wundheilungsprozesses. Dabei weisen die periimplantären anatomischen Strukturen – im Gegensatz zur gingivalen Situation – ein abwehrgeschwächtes Narbengewebe auf [3]. Trotz dieser Abwehrschwäche zeigen dentale Implantate hervorragende Langzeiterfolge auf. Jedoch lassen sich trotz bester Bemühungen biologische und technische Misserfolge vor und während der prothetischen Belastungsphase nicht in allen Fällen vermeiden [15]. In den letzten Jahren haben sich vor allem die biologischen Misserfolge, allen voran die periimplantären Infektionen (Periimplantitis), als wesentliches Problem herausgestellt [2]. Diese sind charakterisiert vor allem durch Zahnfleischtaschenbildung mit Entzündung um den Implantathals, einhergehend mit progredienten Weichgewebs- und Alveolarknochenverlusten bis hin zu einer möglichen Implantatlockerung bzw. dessen Verlust.

Erstmals wurde im Jahre 1993 die Periimplantitis von der European Federation of Periodontology wie folgt klar definiert: Begrenzen sich pathologische Veränderungen osseointegrierter Implantate auf das Weichgewebe, spricht man von periimplantärer Mukositis; ist neben der Weichgewebsentzündung ein entzündlicher Knochenabbau zu verzeichnen, spricht man von Periimplantitis. Jedoch handelt es sich bei der Periimplantitis im Vergleich zur Parodontitis immer um eine lokale Ostitis, da das schützende und sehr immunkompetente Parodontium beim Implantat fehlt [10].

Die Problematik der Periimplantitis hat in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen. Dies liegt vor allem daran, dass mit einer steigenden Anzahl von Implantationen auch die Fälle der periimplantären Infektionen zunehmen [15, 19]. Zudem ist bekannt, dass die Wahrscheinlichkeit des Misserfolgs der Implantation um 30 % ansteigt, wenn bereits zuvor ein Implantatverlust eingetreten war [24]. Eine weitere Problematik besteht darin, dass bei Vorlage einer Periimplantitis die Behandlung zeitaufwändig, teuer und der Erfolg sehr unsicher ist.

Die extrazelluläre Matrix (EZM)

Bei der EZM handelt es sich um den Anteil des Gewebes, der von Zellen in den Interzellularraum (Raum zwischen den Zellen) sezerniert wird. Oberflächlich betrachtet kommt der EZM die Aufgabe der Fixierung der in ihr eingebetteten Zellen zu. Betrachtet man die EZM jedoch genau, so kann man feststellen, dass die EZM mit den in ihr liegenden Zellen interagiert. Die Komponenten der EZM werden von Zellen synthetisiert und sezerniert, aber auch extrazellulär oder (nach Endozytose) intrazellulär abgebaut. Darüber hinaus wird durch die Bindung an bestimmte Komponenten der EZM durch Zellrezeptoren die Expression von Genen in den Zellen reguliert.

Die EZM setzt sich zum größten Teil aus verschiedenen Proteinen und Glykoproteinen sowie Polysacchariden zusammen. Dabei lässt sich die EZM in die Familie der Kollagene, in die Glykosaminoglykane sowie in nichtkollagene Glykoproteine unterteilen.

Die Familie der Kollagene umfasst zurzeit 27 verschiedene Kollagene (Kollagen I – Kollagen XXVII), welche den Hauptproteinanteil der EZM ausmachen [11]. Die große Vielfalt der Kollagentypen und die Anordnung und Vernetzung der Kollagenfibrillen bildet eine wesentliche Grundlage für die mechanische Stabilität der Gewebe. Neben Fibrillen-bildenden Kollagenen, wie Kollagen Typ I, II und III, lassen sich nicht-fibrilläre Kollagene unterscheiden. Als Beispiel für nicht-fibrilläre Kollagene sei das Kollagen Typ IV genannt, welches ein dreidimensionales Netzwerk bildet und so eine der wichtigsten Komponenten von Basalmembranen ist.

Alle Kollagene werden von einer Vielzahl von Zellen (Fibroblasten, Chondroblasten und Osteoblasten) synthetisiert und in die EZM sezerniert. Im Parodontium kommt den Kollagenfasern (Sharpey-Fasern) die Aufgabe der Verankerung des Zahnes im Alveolarknochen zu.

Die EZM unterliegt einem ständigen physiologischen Um- und Abbau, der durch proteolytische Enzyme bestimmt wird. Aber auch bei pathophysiologischen Prozessen können diese Enzyme aktiviert sein. Hierbei spielen Kollagenasen (u.a. MMPs) eine wichtige Rolle [22]. Sowohl entnommene Gewebeproben als auch kultivierte Gewebeproben aus entzündeter Gingiva zeigten eine erhöhte Kollagenaseaktivität im Vergleich zu Gewebeproben aus gesunder Gingiva. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass eine Zunahme der Kollagenaseaktivität in der Sulkusflüssigkeit bei Patienten, die an einer Gingivitis oder Parodontitis erkrankt sind, mit der Progredienz dieser Erkrankung korreliert [25]. Aufgrund dessen wurde in verschiedenen Studien angestrebt, aus der Gruppe der MMPs einzelne auffällige MMPs zu verifizieren [16]. Dabei lag das Augenmerk neben der Pathogenität auf dem sicheren Auftreten der verschiedenen MMPs bei der Parodontitis bzw. Periimplantitis. Im Zuge dieser Untersuchungen zeigten Sorsa et al., dass MMP-8 eine zentrale Rolle bei der Parodontitis einnimmt [22].

Neben den MMPs spielen auch die Cathepsine B und C bei der Entzündungsreaktion eine wichtige Rolle [27]. Durch den Nachweis einer Erhöhung von Cathepsin B, D, G und L bei der chronischen Parodontitis konnte die Beteiligung von Cathepsinen bei der Destruktion parodontaler Strukturen dargelegt werden [5]. Für die Periimplantitis konnte bereits eine Erhöhung von Cathepsin K in der Sulkusflüssigkeit nachgewiesen werden, jedoch konnte Cathepsin K nicht als Markerkeim identifiziert werden [23]. Ein möglicher Grund dafür liegt in der Pathogenese der Periimplantitis. So zeigten kontrollierte Tierstudien, dass es sich bei der Knochenresorption während der fortschreitenden Periimplantitis nicht um einen linearen Prozess handelt [29]. Infolgedessen könnten molekularbiologische Parameter (z. B. Cathepsin K) sowohl die aktive Phase der Gewebsauflösung als auch die ruhende Phase der Erkrankung widerspiegeln [23].

Der Abbau der EZM wird neben der Enzymaktivität auch von der Aktivität und Anzahl der Inhibitoren reguliert, zu denen die Gruppe der TIMPs (Tissue inhibitors of metalloproteinases) gezählt wird. Eine Reihe an Publikationen beschäftigt sich mit der genauen Funktion und Regulation der TIMPs bei der Parodontitis. Dabei kommen die Studien zu unterschiedlichen Vermutungen, wie die unterschiedlichen Genexpressionen der TIMPs zu interpretieren sind. So zeigen einige Studien, dass ein gestörtes Verhältnis zwischen MMPs und TIMPs (zugunsten der MMPs) zu einer Destruktion des Paradontalgewebes führen kann [26]. Daneben konnten einige Studien jedoch auch eine Erhöhung der TIMP-Expression im entzündeten Parodontalgewebe feststellen, was mit dem Bestreben nach einer Gewebehomöostase erklärt wurde [1]. Hierbei scheint der Anstieg der TIMP-Expression bei der Parodontitis jedoch nicht ausreichend, um alle hochregulierten MMPs suffizient zu inhibieren [8].

Fragestellung

Aufgrund des hohen Anteils an extrazellulärer Matrix (EZM) sowohl im Parodontium als auch im periimplantären Knochen hat es sich diese Arbeit zur Aufgabe gemacht, die Genexpression einzelner EZM-Proteine sowie deren abbauender Enzyme mit Hilfe von Microarrays und Real-time(RT)-PCR zu vergleichen, um Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen Parodontitis und Periimplantitis herauszuarbeiten.

Material und Methode

Patientenkollektiv

Die Gewebeproben entstammten von insgesamt 48 Patienten (21 Männer, 27 Frauen, im Alter zwischen 18 und 72 Jahren), die sich im Universitätsklinikum Göttingen in zahnärztlicher Behandlung befanden. Bei jedem Patienten wurde eine ausführliche Anamnese erhoben. Patienten, die Allgemeinerkrankungen wie koronare Herzerkrankungen, Diabetes mellitus oder Syndrome aufwiesen, wurden aus der Studie ausgeschlossen. Darüber hinaus war Nikotinkonsum ein weiteres Ausschlusskriterium. Die Gewebeproben für den gesunden mRNA-Pool wurden von extrahierten gesunden Zähnen (n = 16) entnommen, die im Rahmen einer kieferorthopädischen Behandlung bzw. aufgrund von kariösen Läsionen extrahiert worden waren. Parodontal erkranktes Gewebe wurde von nicht erhaltungswürdigen Zähnen (n = 16) entnommen, die aufgrund einer chronischen Parodontitis extrahiert werden mussten. Zur genauen Differenzierung der beiden Proben wurden die allgemein gültigen klinischen Parameter (Sondierungstiefen, BOP, Attachmentverlust, Zahnlockerung und radiologischer Knochenverlust) erhoben. Zudem wurde jede Probe mittels Real-time(RT)-PCR hinsichtlich der Konzentrationen von Nuclear Factor KappaB (NF-?B) untersucht. NF-?B ist ein Entzündungsmarker, welcher eine wichtige Rolle bei der Regulation der Immunantwort bei Entzündungen spielt und bei diversen Entzündungsprozessen, wie auch bei der Parodontitis und Periimplantitis, aktiv ist [21]. Bei den periimplantären Gewebeproben handelte es sich um Gewebe von 16 enossalen Implantaten (Astra Tech, ITI Bonefit, Brånemark), die aufgrund fortgeschrittener Periimplantitis explantiert wurden. Auch hier wurden bei den Patienten neben einer ausführlichen Anamnese die bereits beschriebenen Befunde erhoben. Alle teilnehmenden Patienten wurden über die Hintergründe dieser Studie aufgeklärt und gaben ihr schriftliches Einverständnis zur Verwendung der Proben. Die Studie wurde durch die Ethikkommission der medizinischen Fakultät der Universität Göttingen genehmigt.

Molekularbiologische Methoden
der Gewebepräparation

Bei der Gewebepräparation wurde vor allem Gewebe aus dem unteren Drittel der Wurzeloberfläche und Implantatoberfläche gewonnen, da sich hier vor allem bei parodontal geschädigten Zähnen noch PDL-Zellen vermuten lassen. Dies ist durch den in dieser Region noch nicht eingetretenen Knochenabbau zu erklären. Die Gesamt-RNA wurde mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) isoliert. Der Ablauf der Isolierung erfolgte nach dem RNeasy-Mini-Protokoll des Herstellers. Um später eine genaue quantitative Bestimmung der Genexpression durchführen zu können, wurden die Proben mit DNase I (RNase-free) (Fa. Ambion, Austin, USA) behandelt [12].

Zur Qualitätssicherung wurden die RNA-Proben auf ihre Qualität/Güte mittels Agilent Bioanalyzer Chips (Agilent 2100 Bioanalyzer, Fa. Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) getestet (Abb. 2). Hierfür kam das RNA 6000 Nano LabChip kit (Fa. Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) zur Konzentrationsbestimmung zum Einsatz. Zudem erfolgte die quantitative Bestimmung der RNA-Konzentration durch geeignete Verdünnungen der Proben mit nukleasefreiem Wasser und photometrischer Messung (Photometer Gene Quant) bei einer Absorption von 260 nm. RNA-Lösungen mit einer Ratio von 1,8 bis 2,0 wurden als ausreichend rein angesehen, um sie in den weiteren Versuchen einzusetzen.

Durch das Advantage RT-for-PCR-Kit (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) erfolgte die Umschreibung der RNA in eine doppelsträngige cDNA durch eine im Kit enthaltene Moloney Murine Leukemia Virus reverse Transkriptase (RT), die an einen Oligo-(dT)-Primer mit modifizierter 5´-T7-RNA-Polymerase-Promoter-Sequenz bindet.

Im Folgenden wurden gleiche Mengen der Total-RNA-Lösungen aus den verschiedenen Gewebeproben in die drei zu untersuchenden Gruppen „gesundes PDL“ (Kontrollgruppe), „entzündetes PDL“ und „entzündetes periimplantäres Gewebe“ gepoolt.

Microarray-Untersuchung

Zur relativen mRNA-Bestimmung der drei beschriebenen Gruppen wurde der Affymetrix HG-U133A 2.0 GenChip (Fa. Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) verwendet. Dieser untersucht 14.239 humane Gene mittels 22.283 auf dem GenChip befindlichen Primern. Der GenChip wurde mit cRNA-Fragmenten hybridisiert, welche eine maximale Länge von 100 bis 150 Basen aufwiesen. Die Hybridisierung erfolgte für 16 Stunden bei 45°C. Im Anschluss wurde der GenChip in einer automatischen Affymetrix fluidic station gewaschen und durch Zugabe von Streptavidinphycoerythrin (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) fluoreszenzmarkiert. Für jeden Pool an cRNA wurden zwei GenChips hybridisiert, sodass insgesamt sechs Chips verwendet wurden. Die markierten GenChips wurden durch einen Hewlett-Packard-Gene-Array-Scanner (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) gescannt. Eine komplette Liste der auf dem HG-U133A präsentierten Gene kann in der Affymetrix-Datenbank (http://www.affymetrix.com/analysis/index.affx) eingesehen werden. Durch die Verwendung des Affymetrix Microarray Suite 5.0 wurden die Daten analysiert und mit Hilfe des Affymetrix Data Mining Tool evaluiert. Dabei wurden Gene mit einem mindestens zweifach höheren oder niedrigeren Unterschied in der Signalintensität von zwei unabhängigen Experimenten als reguliert bestimmt. P-Werte wurden für hoch regulierte Gene < 0,001 gesetzt und für herunter regulierte Gene auf > 0,999. Das niedrigere als auch das höhere Niveau der Signal-log-Ratio wurde mit einem 95%igen Konfidenzintervall angenommen.

Real-time(RT)-PCR

Zur Verifizierung der in den Microarray-Analysen gewonnenen Ergebnisse wurde die Real-time(RT)-PCR herangezogen. Dabei liegt der Vorteil der Real-time(RT)-PCR in ihrer sehr hohen Sensitivität und ermöglicht eine quantitative Analyse. Dazu wurden exemplarisch ein bis zwei Gene aus jeder Hauptgruppe untersucht. Bei der hierfür verwendeten cDNA handelte es sich um dieselben Proben, die auch für die Hybridisierung der Microarray-Versuche eingesetzt wurden.

Die für die PCR notwendigen spezifischen Primersequenzen wurden der Datenbank von NCBI (NCBI Blast: Nucleotide-nucleotide Blast [blastn], www.ncbi.nlm.nih.gov) entnommen. Die sich daraus ergebenden, für die Untersuchung spezifischen Primersequenzen wurden anschließend von der Firma Operon Biotechnologie GmbH (Köln, Deutschland) synthetisiert. Zur Bestimmung der für jeden Primer spezifischen Annealing-Temperatur wurde eine Gradienten-PCR durchgeführt. Mittels einer Sequenzierung der Gradienten-PCR-Produkte wurden die verwendeten Primer reevaluiert und ihre Signifikanz nachgewiesen. Die Sequenzierung, unter der Verwendung der Methode nach Sanger [6], erfolgte durch die Sequence Laboratories Göttingen GmbH (Göttingen, Deutschland). Die so erhaltenen Nukleotidsequenzen wurden mit der NCBI-Nukleotiddatenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) abgeglichen. Eine Übersicht über die verwendeten Primer findet sich in Tabelle 1.

Die Real-time(RT)-PCR wurde mit dem Mastercycler ep gradients, realplex² der Firma Eppendorf sowie mit SYBR Green I Master-Mix (Eppendorf Real Master Mix 2.5x, PCR Kit, FA. Eppendorf, Hamburg, Deutschland) als fluoreszierendes Molekül durchgeführt. Während der DNA-Amplifikation wurde die Fluoreszenzintensität kontinuierlich durch eine im optischen Modul des Mastercycler integrierte CCD-Camera erfasst. Der verwendete Ansatz aus 12,5 µl des SYBR Green I Master-Mix, 20 pmol Primer, sowie 250 ng cDNA wurden zu einem Gesamtvolumen von 25 µl mit DEPC-Wasser aufgefüllt und für die PCR verwendet.

Zu Beginn der PCR erfolgte eine einmalige Initialdenaturierung der DNA für 2 min bei 95°C. Daran schloss sich der 45-mal wiederholende Zyklus, bestehend aus einer Initialdenaturierungsphase (2 min bei 95°C), einer Denaturierungsphase (3 sec bei 95°C), einer Anlagerungsphase (20 sec bei Annealing-Temp – siehe Tab. 1) und einer Elongationsphase (29 sec bei 68°C) an. Am Ende der 45 Zyklen erfolgte die Generierung einer Schmelzkurve (Rampenzeiten: 20 sec bei 50°C–95°C in 0,3°C Schritten), die durch Messung der Extinktion des SYBR Greens I graphisch dargestellt wurde (Abb. 3). Die Real-time(RT)-PCR-Amplifikationseffizienz wurde durch die von der Mastercycler-ep-Realpex-S-Software dargestellten Kurven ermittelt und mit einer hohen Effizienz (Ratio 2.01) bewertet. Zur Qualitätssicherung wurden die Versuche in drei Durchgängen á drei Proben durchgeführt. Dabei lagen die Inter-test-Variationen bei ? 2 % und die Intra-test-Variationsbreite bei ? 1 %. Die Berechnung der relativen Ratios erfolgte unter der Benutzung des Algorithmus nach Pfaffl [14]. Die Normalisierung der Real-time-Ergebnisse erfolgte über das Housekeeping-Gen-Hypoxanthine-Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT-1).

Der Vergleich zwischen den Erkrankungen Parodontitis und Periimplantitis erfolgte über den Zwischenschritt des Vergleiches der jeweiligen Erkrankung mit dem Expressionsmuster des gesunden Parodontiums (neutraler Bezugspunkt). Zuerst wurden die beiden entzündeten Gewebe (parodontal und periimplantär entzündetes Gewebe) mit dem gesunden parodontalen Gewebe verglichen und in einem zweiten Schritt wurden die beiden Erkrankungen miteinander verglichen. Die so normalisierten Genexpressionswerte sind in Tabelle 2 zusammengefasst dargestellt und nach den Gesichtspunkten „erhöht“ (increased = I), „erniedrigt“ (decreased = D) und „keine Veränderung“ (no change = NC) bewertet. Dabei wurden Gene mit einem mindestens zweifach höheren oder niedrigeren (fold change Ratio +/? 2) Unterschied in der Signalintensität als differenziert reguliert bestimmt. Dies entsprach einer ungefähren Abweichung von +/? 0,5 Punkten bei den CT-Werten (cycle thresholds) der Real-time(RT)-PCR, dies wurde als eine signifikante Veränderung definiert.

Ergebnisse

Probenverifizierung der gewonnenen mRNA

Die vor der Microarray-Analyse durchgeführte Real-time(RT)-PCR zur Bestimmung des Entzündungsmarkers (Transkriptionsfaktor) NF-?B zeigte in den chronisch entzündeten Geweben (Parodontitis und Periimplantitis) im Vergleich zum gesunden PDL ein deutlich erhöhtes Expressionsmuster. Dieser Nachweis bestätigte neben der klinischen Diagnostik der Proben, dass es sich bei den Gewebeproben tatsächlich um chronisch entzündetes Gewebe (Parodontitis bzw. Periimplantitis) handelte. Das Expressionsmuster von NF-?B zwischen den beiden chronisch entzündeten Geweben war wiederum sehr ähnlich.

Ergebnisse der Microarray-Analysen

Bei der Untersuchung von 22.283 humanen Genen konnten 2.079 Gene mit einer differenzierten Genexpression mit einem mindestens zweifach höheren oder niedrigeren Unterschied (fold change Ratio +/? 2) dargestellt werden.

Dabei waren die Expressionsdaten von 1093 Genen bei dem chronisch entzündeten periimplantären Gewebe im Vergleich zum chronisch entzündeten parodontalen Gewebe signifikant hoch reguliert (fold change Ratio +2) und die Expression von 986 Genen signifikant herunter reguliert (fold change Ratio –2). In Tabelle 3 findet sich eine Übersicht über die von uns schwerpunktmäßig untersuchten Komponenten der EZM sowie deren abbauender Enzyme.

Ergebnisse der Real-time(RT)-PCR

Zur Verifizierung der aus den Microarray-Untersuchungen gewonnenen Ergebnisse wurde eine Auswahl an Proteinen mit Hilfe der real-time (RT)-PCR untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Cathepsine B und C (CTSB und CTSC) bei der Real-time-PCR eine erhöhte Genexpression bei der Periimplantitis im Vergleich zum gesunden parodontalen Gewebe aufwiesen. Hierbei lagen die Ratios bei 25,599 und 21,873. Aus der Gruppe der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) wurden MMP-2, -8, -9 und -23B untersucht, wobei für MMP-2 und -9 im periimplantär entzündeten Gewebe ein erhöhtes Expressionslevel nachgewiesen werden konnte. Die Ratio betrug dabei 3.802 bzw. 25.368. Wiederum konnten bei MMP-8 und MMP-23B keine signifikanten Änderungen für die Periimplantitis im Vergleich zur Parodontitis festgestellt werden.

Aus der Gruppe der Kollagene wurde Kollagen IV (alpha1) untersucht und eine erhöhte Ratio (24,489) festgestellt.

Gegenüberstellung der Microarray- und
Real-time(RT)-PCR-Ergebnisse

Aufgrund der größeren Sensivität der Real-time(RT)-PCR konnten bei einigen Genen Genexpressionsunterschiede festgestellt werden, die mit Hilfe der Microarray-Technologie nicht nachgewiesen werden konnten (MMP9, CTSB, CTSC). Ansonsten stimmten die Ergebnisse aus den beiden Metho-
den überein (Tab. 4).

Diskussion

Das klinische Erscheinungsbild der chronischen Periimplantitis lässt eine ähnliche Ätiologie wie die der chronischen Parodontitis vermuten. Durch eine Reihe an Studien konnte diese Vermutung auch bestätigt werden [20]. Dabei basiert der primäre ätiologische Faktor der beiden Erkrankungen auf einer vermehrten Plaqueansammlung am Zahn bzw. Implantat, infolgedessen es zu destruktiven Veränderungen der umliegenden Hart- und Weichgewebe kommt. Bei dieser Betrachtung muss jedoch berücksichtigt werden, dass es sich um zwei verschiedene Gewebetypen (Zahn = Desmodont = Weichgewebe; Implantat = Knochen = Hartgewebe) handelt, was zu einer unterschiedlichen Pathogenese der beiden Erkrankungen führen kann. Eine klare Abgrenzung der Periimplantitis von der Parodontitis fehlt jedoch bislang.

In dieser Arbeit wurden mittels Microarray-Technologie 22.283 humane Gene im gesunden und im chronisch entzündeten Parodontalgewebe sowie im chronisch entzündeten periimplantären Gewebe vergleichend untersucht. Aufgrund der großen Datenmenge konzentrierte sich diese Arbeit auf die EZM-Komponenten sowie die abbauenden Enzyme. Zum einen deshalb, um signifikant differenziert exprimierte Gene innerhalb dieser beider wichtigen Gruppen herauszufiltern und zum anderen, um mögliche Unterschiede zwischen der Parodontitis und der Periimplantitis zumindest auf der mRNA-Ebene zu erarbeiten.

Da sowohl die angewandte Microarray-Technologie als auch die Real-time-RT-PCR ausschließlich mRNA untersucht, muss an dieser Stelle hinzugefügt werden, dass der alleinige Nachweis von mRNA nicht das Vorhandensein des dazugehörigen Proteins bzw. dessen Sekretion und damit seine biologische Wirksamkeit bedeutet. Im Folgenden diskutieren wir die möglichen Rollen der untersuchten Gene in der Annahme, dass die mRNA-Menge mit der Menge an dazugehörigen Proteinen im periimplantären Gewebe und im parodontalen Gewebe korelliert. Dieses entspricht der heutigen Expertenmeinung.

Matrix-Metalloproteinasen (MMPs)

Eine Reihe an Studien konnte die erhöhte Expression von MMP-8 sowohl bei der adulten als auch bei der juvenilen Parodontitis (aktuelle Nomenklatur: chronische bzw. aggressive Parodontitis) bestätigen [16]. Bei unseren Untersuchungen konnten keine signifikanten Änderungen von MMP-8 und MMP-23B für die Periimplantitis im Vergleich zur Parodontitis festgestellt werden. Dies heißt jedoch nicht, dass diese MMPs keine Rolle bei der Periimplantitis spielen, vielmehr bedeutet das, dass MMP-8 und MMP-23B bei der Periimplantitis im Vergleich zur Parodontitis nicht differenziert exprimiert werden. Jedoch war ein Anstieg der MMP-2- und MMP-9-Konzentrationen bei der Periimplantitis nachweisbar. Die Korrelation zwischen MMP-2-Anstieg und Destruktion der parodontalen Strukturen konnte bereits nachgewiesen werden [28].

Gewebeinhibitoren der Metalloproteinasen (TIMPs)

Im Vergleich zu der Fülle an Publikationen über die Expression von TIMPs bei der Parodontitis sind für die Periimplantitis zurzeit nur wenige Studien verfügbar. Eine Studie von Nomura et al. belegt den Anstieg der Konzentrationen an MMP-1, MMP-8 und TIMP-1 im Wundbereich nach Implantatinsertion [13].

Die vorliegende Studie zeigt, dass TIMP-1 bei der Periimplantitis im Vergleich zum Gesunden herunter reguliert ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Genexpression von TIMP-1 und TIMP-3 im Vergleich zur Periimplantitis bei der Parodontitis stärker herunter reguliert ist. Dieses könnte bedeuten, dass eine im Verhältnis höhere Expressionsrate dieser beiden TIMPs bei der Periimplantitis zu einer besseren Inhibition der MMPs im periimplantär entzündeten Gewebe führt.

Cathepsine (CTS)

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eine signifikante Erhöhung der mRNA für Cathepsin B und Cathepsin C sowohl bei der Parodontitis als auch bei der Periimplantitis. Zudem veranschaulichen die Ergebnisse den engen Zusammenhang zwischen Knochenresorption und dem Vorhandensein von Cathepsin B und C. So lassen sich bei der Periimplantitis ein ungefähr doppelt so hoher Anstieg von Cathepsin B und ein fünffach höherer Anstieg von Cathepsin C im Vergleich zur Parodontitis nachweisen. Diese Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass die Cathepsine eine wichtigere Rolle bei dem hydrolytischen Abbau der EZM des periimplantären Gewebes im Vergleich zum parodontalen Gewebe haben.

Kollagene

Betrachtet man die Expression der Kollagene bei der Periimplantitis, so muss berücksichtigt werden, dass aufgrund des angestrebten Phänomens der Osseointegration im Bereich des enossalen Implantats primär keine Ausbildung eines Parodontalligaments stattfindet [9]. Demnach ist das dort primär nachzuweisende Kollagen vom Typ I. Dieser baut 90 % der organischen Matrix des Knochens auf. Weitere Kollagene lassen sich noch im supraalveolär gelegenen gingivalen Faserbündel nachweisen [20]. Im Vergleich zum Zahn zeigt diese Zone hinsichtlich ihrer Zusammensetzung ein vergleichbares Muster an Kollagen Typ I, III und IV auf, jedoch ist ein erhöhtes Vorkommen an Kollagen Typ V festzustellen [18]. Dieses supraalveoläre Bindegewebe scheint die Tiefenproliferation des Saumepithels zu limitieren [20]. Der durch unsere Ergebnisse dokumentierte Anstieg von Kollagen Typ IV bei der Periimplantitis kann im Zusammenhang mit der fortschreitenden Proliferation des Saumepithels und des restlichen Bindegewebes nach apikal in Verbindung stehen. So lässt sich Kollagen Typ IV als ein Hauptbestandteil der Basalmembran des Saumepithels verifizieren [4].

Während der Knochenheilung spielt die Synthese der verschiedenen Kollagene eine entscheidende Rolle. Die Knochenheilung wird durch Bildung von Osteoid und die darauf folgende Mineralisation abgeschlossen. Aufgrund ihrer supramolekularen Struktur wird die Gruppe der Kollagene in zwei Hauptgruppen unterteilt, und zwar in die fibrillären Kollagene (Kollagen Typ I, II, III, V, und XI) und in die nicht-fibrillären Kollagene (alle restlichen Kollagene). Die beiden Gruppen unterscheiden sich u. a. in der Fähigkeit zur Geweberegeneration. Der Gruppe der fibrillären Kollagene ist lediglich eine langsame Regeneration von Geweben möglich. Hingegen zeigen die nicht-fibrillären Kollagene eine heterogene Gruppe von supramolekularen Strukturen und Netzwerken, welche sie zu einer schnelleren Geweberegeneration befähigen.

Diese Arbeit konnte zeigen, dass die mRNA-Expression von Kollagen Typ IV, VI, VII und XVII bei der Periimplantitis im Vergleich zur Parodontitis hoch reguliert ist und die mRNA-Expression von Kollagen Typ III und XI herrunter reguliert ist. Demzufolge zeigen nur nicht-fibrilläre Kollagene (Typ IV, VI, VII und XVII) eine erhöhte Genexpression, wobei die fibrillären Kollagene (Typ III und XI) eine reduzierte Genexpression in der Periimplantitis aufweisen. Dieses Ergebnis lässt die Vermutung zu, dass periimplantäres Gewebe im Vergleich zum parodontalen Gewebe zur schnelleren Geweberegeneration fähig ist und somit einem potenziell höheren Turnover unterliegt.

Zusammenfassung und Ausblick

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die vorliegende Arbeit unter Verwendung der Microarray-Technologie und der Real-time(RT)-PCR eindeutige Genexpressions-Unterschiede zwischen chronisch entzündeten periimplantären Geweben und chronisch entzündeten parodontalen Geweben aufzeigt. Beim Betrachten der untersuchten Gruppen der EZM und ihrer abbauenden Enzyme konnten eindeutige Unterschiede im Expressionslevel einzelner Gene festgestellt werden. Dieses lässt die Vermutung zu, dass trotz gleicher ätiologischer Genese die Periimplantitis auf genetischer Ebene klar von der Parodontitis abgrenzbar ist. Dabei lassen die gewonnenen Ergebnisse Vermutungen zu, welche Gene bei der vergleichenden Betrachtung der chronischen Parodontitis und der chronischen Periimplantitis eine gewichtigere bzw. geringere Rolle spielen könnten. Dennoch lassen sich die Ergebnisse dieser Arbeit nur als ein Hinweis auf mögliche Unterschiede beider Krankheitsentitäten sehen. Es sind weitere Studien zwingend notwendig, um ein noch besseres Verständnis der Periimplantitis bezüglich ihrer Pathogenese sowie ihrer Zusammenhänge und Unterschiede zur Parodontitis auf molekularbiologischer Ebene zu erlangen.

Interessenskonflikt: Diese Arbeit wurde durch die Universitätsmedizin Göttingen (#140 1490) und die Deutsche Gesellschaft für Implantologie (DGI-13 4708 0) gefördert.

Korrespondenzadresse

Dr. Nikolaus Gersdorff

Kommissarischer Direktor der Abteilung Prothetik

Universitätsmedizin Göttingen

Robert-Koch-Str. 40, 37075 Göttingen

Tel.: +49 (0) 551 / 3922874, E-Mail: ngersdo@gwdg.de

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Fussnoten

1 Abteilung Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie, Arbeitsgruppe Geweberegeneration, Universitätsmedizin Göttingen, Robert-Koch-Str. 40,
37075 Göttingen

2 Abteilung Prothetik, Arbeitsgruppe Geweberegeneration, Universitätsmedizin Göttingen, Robert-Koch-Str. 40, 37075 Göttingen

DOI 10.3238/ZZI.2011.0033


(Stand: 17.06.2015)

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