In-vitro-Untersuchungen zum Screening von Implantatoberflächeneigenschaften*

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H.-L. Graf1, J. Hofmann1, U. Tröger1, J. Schreckenbach2, H. Hilbig3

In einer Kurzzeitkultur humaner Knochenzellen vom Oberkiefer über zehn Tage wurden die Expressionen der nonkollagenen Knochenmatrixproteine Osteonectin, Osteocalcin und Bone Sialoprotein auf vier klinisch verwendeten und drei experimentell hergestellten Implantatoberflächen quantitativ bestimmt.

Die Experimentaloberflächen Titan-Kalzium-Magnesium-ANOF und Titan-Kalzium-Magnesium-Fluor-ANOF zeigen zu den meisten Messzeitpunkten hohe Expressionen der Knochenzellmarker. Diese Ergebnisse machen weitere Untersuchungen mit Magnesium- und Fluoridmodifikationen empfehlenswert.

Sowohl die chemische Zusammensetzung als auch die Mikrostruktur der untersuchten Oberflächen haben Einfluss auf die Proteinexpression und können offenbar zu verschiedenen Einheilungsmechanismen führen.

Schlüsselwörter: Bone Sialoprotein, Osteonectin, Osteocalcin, Screening, Magnesium, Fluor, Selen

Einleitung

Die Insertion enossaler Implantate als Verankerungselement für Zahnersatz stellt die vorläufig höchste Entwicklung der prothetischen Zahnheilkunde dar.

Alle gebräuchlichen Implantatsysteme basieren auf der enossalen Einpflanzung rotationssymmetrischer Formkörper, deren Oberflächen hinsichtlich Mikrostruktur, Nanostruktur sowie chemischer Zusammensetzung erheblich variieren. In diesen Unterschieden sieht man den entscheidenden Modulator für die Geschwindigkeit der Knochenkontaktnahme am Implantat, von der die klinische Behandlungsdauer direkt abhängig ist. Aus naheliegenden Gründen soll diese verkürzt werden, weshalb die Oberflächenentwicklung einen der Forschungsschwerpunkte der Implantologie darstellt. Dazu soll die vorliegende Arbeit durch Erprobung eines In-vitro-Screenings an bekannten Oberflächen, sowie deren Anwendung auf klinisch unbekannte Experimentaloberflächen mittelbar einen Beitrag leisten.

In-vitro-Untersuchungen zur Osteokompatibilität werden meist unter Verwendung humaner oder tierischer Osteoblastenvorläufer oder Osteoblasten durchgeführt. Die Expression von kollagenen Knochenmatrixproteinen, wie Kollagen Typ I [1, 5] und von nonkollagenen Knochenmatrixproteinen wie Osteocalcin [18, 20], Osteonectin [13, 14] oder Bone Sialoprotein (BSP) [5, 13, 14] gelten als Maß der Osteoblastendifferenzierung. Reife Osteoblasten sezernieren eine Matrix, welche Keimbildungsstellen enthält, an denen nanokristallines Kalziumphosphat angelagert werden kann.

Osteonectin moduliert vermutlich die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen und ist somit wichtig für die Organisation dieser extrazellulären Matrix. Dies und die hohe Affinität zu Kalzium und Kollagen machen die Bestimmung von Osteonectin interessant.

Osteocalcin ist ein kalziumbindendes Protein und gilt als Marker differenzierter Osteoblasten. Eine Zunahme der Osteocalcinsekretion wird als weitere Differenzierung interpretiert. Eine höhere Rauheit gestrahlter und geätzter Oberflächen korreliert mit einer vermehrten Osteocalcinproduktion [2, 3].

Die Bestimmung der exprimierten Osteocalcinmenge erscheint sinnvoll, um Aussagen über das Stadium der Osteoblastendifferenzierung zu treffen und den beschriebenen Zusammenhang zu verschieden rauen Implantatoberflächen zu untersuchen.

BSP wurde in der von Osteoblasten gebildeten kollagenfreien Matrix nachgewiesen, die als erste Schicht auf Implantatoberflächen abgelagert wird [6]. Die Möglichkeit von BSP, in vitro an Hydroxylapatitkeime zu binden, sowie seine Expression während der frühen Mineralisationsphase des Knochengewebes deuten auf eine Beteiligung bei der Initialisierung der Mineralisation von Geweben hin [6, 12].

Deshalb wurden diese Proteine zur Charakterisierung humaner Knochenzellkulturen auf verschiedenen Probekörpern verwendet.

Material und Methoden

Gewebegewinnung und Zellkultivierung

Im Rahmen eines oralchirurgischen Eingriffes an der Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie der Universität Leipzig wurde nach Aufklärung und schriftlicher Einverständniserklärung des männlichen Patienten, sowie nach Zustimmung durch die Ethikkommission der Universität Leipzig, Knochengewebe entnommen und in sterile, isotonische phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Penicillin und Streptomycin überführt, zerkleinert und zum Entfernen der Blutreste mit sterilem PBS gespült. Um das Wachsen der Knochenzellen aus dem entnommenen Gewebe zu beschleunigen, erfolgte die Inkubation der Knochenstücke mit 0,25%-iger Kollagenase in PBS im Brutschrank, bei 37°C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit. Nach einer Einwirkzeit von 30 Minuten wurde die Kollagenase abgesaugt, verworfen und für weitere zwei Stunden durch frische Lösung ersetzt, anschließend das Präparat für zehn Minuten bei 300 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert, das entstandene Pellet mit 1 ml Nährmedium resuspendiert, nachfolgend in eine Zellkulturflasche (25 cm²) überführt und mit 2 ml Nährmedium aufgefüllt.

Die Zellkultur wurde sieben Tage im Brutschrank belassen. Danach erfolgte jeden dritten Tag ein Austausch des Nährmediums und die mikroskopische Kontrolle des Zellwachstums. Nachdem auf der Kulturfläche nach frühestens sechs Wochen ein konfluentes Wachstum erreicht war, konnte das erste Passagieren der Zellen durchgeführt werden. Dazu mussten das Nährmedium abgesaugt und die Zellen sorgfältig mit sterilem PBS gespült werden. Das Ablösen der Zellen vom Boden des Kulturgefäßes erfolgte enzymatisch durch eine zweiminütige Inkubation mit 0,5 %igem Trypsin in PBS. Um die Trypsinierung zu unterbrechen, ist nach Ablauf der Inkubationszeit 5 ml Nährmedium zugefügt worden. Die entstandene Zellsuspension wurde abpipettiert, in ein Zentrifugenglas überführt, bei 300 g zehn Minuten zentrifugiert, der Überstand abgesaugt und das Zellpellet vorsichtig mit 5 ml frischem Nährmedium resuspendiert. Je 2,5 ml dieser Zellsuspension sind in eine 75 cm² Zellkulturflasche pipettiert, mit 14 ml Nährmedium aufgefüllt und im Brutschrank mit dreitägigem Mediumwechsel bis zum konfluenten Zellwachstum belassen worden.

Um für den Versuchsansatz eine ausreichende Anzahl von Zellen zu gewinnen, musste eine zweite Passage des konfluenten Zellrasen erfolgen. Für die zweite Subkultur wurden die Zellen wieder trypsiniert, zentrifugiert und das entstandene Pellet resuspendiert.

Jeder der sieben Probekörper wurde nach dem Autoklavieren bei 134°C in eine Kammer des Lab Tec II Chamber Slide System gelegt. Die Herstellung der Zellsuspension erfolgte wie bei der Passagierung beschrieben. Die Zellkonzentration ist auf 4000 Zellen pro ml Medium eingestellt worden. Auf jeden Probekörper wurden 0,5 ml dieser Suspension pipettiert. Die so verteilten Knochenzellen konnten nun auf den Probekörpern für jeweils drei, fünf, sieben oder zehn Tage im Brutschrank wachsen (Mediumwechsel aller drei Tage).

Immunhistochemische Markierung

Die Expression von BSP, Osteocalcin und Osteonectin wurde mittels Fluoreszenz-Immunhistochemie nachgewiesen [11]. Für die Markierung des Osteonectins war der Einsatz von HEPES – Puffer notwendig, da der Osteonectin-Primärantikörper nur in Anwesenheit von Kalzium reagiert. Sonst konnte mit PBS gearbeitet werden.

Nach Ablauf der Versuchszeiten (drei, fünf, sieben und zehn Tage) wurden die Zellen zehn Minuten mit 4%igem Paraformaldehyd in PBS fixiert, viermal fünf Minuten in PBS bzw. HEPES gespült und mit Ziegenormalserum (10 %, mit 2 % bovinem Serumalbumin [BSA] in PBS bzw. HEPES) eine Stunde inkubiert. Die Verdünnung der nachfolgend für 16 Stunden zugesetzten Primärantikörper für BSP und Osteocalcin betrug 1:100 in PBS mit 2 % BSA, für Osteonectin in HEPES mit 2 % BSA. Im Anschluss wurden die Probekörper viermal fünf Minuten mit dem jeweiligen Puffer gespült und danach 30 Minuten mit dem Sekundärantikörper Ziege-anti-Maus, CY-3- konjugiert (1:200 in PBS bzw. HEPES mit 2 % BSA) inkubiert. Nach einer weiteren Spülung von dreimal fünf Minuten mit dem entsprechenden Puffer schloss sich die Gegenfärbung der Zellkerne mit DAPI (1:1000 in PBS für eine Minute) an. Die Kammern der Chamber Slides wurden vom Objektträger abgetrennt, auf die Probekörper das Eindeckmedium gegeben und mit einem Deckglas abgedeckt.

Quantitative Auswertung der Proteinexpression

Die quantitative Bestimmung der Proteinexpression auf den Probekörperoberflächen erfolgte an den festgelegten Versuchstagen durch Errechnung des relativen Grauwertes. Jeder Probekörper wurde an sechs festgelegten Stellen mit dem Fluoreszenzmikroskop Axiophot und der darauf installierten Kamera Axiocam mit 200-facher Vergrößerung fotografiert und die Bilder digital gespeichert. In diesem Versuch wurde der UV-Filter zur Darstellung der Zellkerne und der TRITC-Filter zur Darstellung der nichtkollagenen Proteine verwendet. Die separat entstanden Bilder können durch geeignete Software (Axiovision 4.0) zu einem Bild zusammengefasst werden.

Die Bestimmung des relativen Grauwertes erfolgte für jedes der angefertigten Bilder einzeln und nach dem gleichen Muster. Der relative Grauwert ist definiert als Quotient aus mittlerem Grauwert und Belichtungszeit. Die Messung der benötigten Werte erfolgte durch das Programm Axiovision 4.0. Dazu musste um jedes Bild ein Rahmen mit einer Fläche von 440x330 µm gelegt werden. Die mittleren Grauwerte und Belichtungszeiten für die einzelnen Aufnahmen wurden durch das Tabellenkalkulationsprogramm Excel erfasst, der relative Grauwert errechnet und graphisch dargestellt (GW/BZ).

Probekörper

Für den Versuch wurden runde Titangrundkörper mit einem Durchmesser von 6 mm und einer Dicke von 0,5 mm verwendet. Die Oberflächen der Grundkörper wurden nach den Vorgaben des Versuchsprotokolls bearbeitet. Das Versuchprotokoll umfasste vier klinisch verwendete und drei experimentell hergestellte Oberflächen. Die vorgenommen Modifikationen sind nachfolgend aufgelistet.

Klinisch verwendete Oberflächen

– Geätzte Oberfläche (Ti-ät)

Die Oberfläche des Titangrundkörpers (ZL-Microdent) wird durch subtraktive Verfahren konditioniert. Dabei wirkt eine Mischung aus konzentrierter Schwefel- und Salzsäure bei Normaldruck auf den Versuchskörper ein (Abb. 1A).

– TICER-Oberfläche (Titan/Ceramic)

Die TICER - Oberfläche wird durch die Firma ZL-Microdent auf dem klinisch bewährten und sehr gut untersuchten [7–9] Implantatsystem ZL-Duraplant eingesetzt. Der Implantatgrundkörper besteht aus Reintitan. Die Oberfläche wird durch eine Konversionstechnik hergestellt. Dabei kommt die von Krysmann [15] beschriebene anodische Oxidation unter Funkenentladung (ANOF) zum Einsatz. Der Grundkörper wird in einem gesättigten Kalziumdihydrogenphosphat-Elektrolyten als Anode geschaltet. Bei Anlegen eines gepulsten Gleichstroms kommt es auf der Oberfläche des Titangrundkörpers zur Ausbildung einer ANOF-Schicht, welche Titan, Sauerstoff, Kalzium und Phosphor enthält (Abb. 1B).

– TiUnite-ähnliche-Oberfläche (TiUniteÄ)

Der Implantatgrundkörper besteht aus Reintitan (ZL-Microdent). Die Oberfläche (Abb. 1C) wird durch eine Konversionstechnik [15] hergestellt und ähnelt sowohl morphologisch als auch chemisch stark der original TiUnite-Oberfläche. Bei der TiUnite-Oberfläche handelt es sich im Wesentlichen um ein technisches Pendant der TICER-Oberfläche. Der Grundkörper wird als Anode in einer Elektrolysezelle geschaltet. Der Elektrolyt besteht aus einem Gemisch aus Schwefel- und Phosphorsäure. Bei Anlegen einer Gleichspannung über 150 V bei Raumtemperatur und Normaldruck entsteht die in Abbildung 1C gezeigte Oberfläche. In dieser können Titan, Sauerstoff, Phosphor und Schwefel nachgewiesen werden.

– Maschiniertes Reintitan (CPT, Commercial Pure Titanium)

Bei der Reintitan-Oberfläche (ZL-Microdent) handelt es sich um eine maschinenbearbeitete Titanoberfläche, die infolge Spontanoxidation als Titanoxidoberfläche, vorliegt. In Abbildung 1D zeigen sich die typischen, mikroskopisch kleinen Rillen.

Experimentaloberflächen

– Titan-Selen-ANOF (Titan-Se)

Der Implantatgrundkörper besteht aus Reintitan. Die Oberfläche wird durch transformative Techniken modifiziert. Dabei kommt die beschriebene anodische Oxidation unter Funkenentladung (ANOF [15]) zum Einsatz. Der Grundkörper wird als Anode, eine Titanelektrode als Kathode, Kalziumdihydrogenphosphat- und Natriumselenatlösung als Elektrolyte in einer Elektrolysezelle geschaltet. Beim Anlegen einer Impulsspannung von 110 V bei Raumtemperatur und Normaldruck kommt es zur Ausbildung einer ANOF-Schicht (Abb. 1E), welche Titan, Sauerstoff, Natrium, Kalzium, Phosphor und Selen enthält.

– Titan-Kalzium-Magnesium-ANOF (Ti-Mg)

Der Implantatgrundkörper besteht aus Reintitan. Die Oberfläche wird durch die ANOF-Technik [15] hergestellt. Der Grundkörper wird als Anode in einer Elektrolytmischung aus Magnesiumdihydrogenphosphat und Phosphorsäure geschaltet. Beim Anlegen einer Impulsspannung bei Raumtemperatur und Normaldruck kommt es zur Ausbildung der abgebildeten ANOF-Schicht (Abb. 1F). Neben Titan und Sauerstoff können Kalzium, Magnesium und Phosphor auf der Oberfläche des Grundkörpers nachgewiesen werden.

– Titan-Kalzium-Magnesium-Fluor-ANOF (Ti-Mg-F)

Der Implantatgrundkörper besteht aus Reintitan. Die Oberfläche (Abb. 1G) wird durch transformative Techniken modifiziert [15]. Der Grundkörper wird als Anode in einer gemischten Magnesiumhydrogenphosphat- und Kalziumfluoridlösung (Elektrolyt) geschaltet. Bei Anlegen einer Impulsspannung (Raumtemperatur und Normaldruck) kommt es zur Ausbildung der abgebildeten ANOF-Schicht. In dieser sind Titan, Sauerstoff, Kalzium, Magnesium, Phosphor und Fluor enthalten.

Ergebnisse

Klinisch verwendete Oberflächen

Die Expression von Osteonectin steigt bis zum zehnten Versuchstag für die geätzte Oberfläche, TICER und Reintitan stetig an (Abb. 2). Die höchste Expression findet sich am zehnten Versuchstag. Die TiUnite-ähnliche-Oberfläche induziert am fünften und siebten Versuchstag ein Gleichbleiben der Osteonectinproduktion, aber auch hier wird am zehnten Versuchstag ein Maximum erreicht. Die niedrigste Expression von Osteonectin am zehnten Versuchstag wird bei Knochenzellen gemessen, welche auf der geätzten Oberfläche wachsen.

Als einziger Probekörper induziert die TiUnite-ähnliche-Oberfläche einen stetigen Anstieg der Osteocalcinproduktion bis zum Maximum am Versuchstag zehn. Der absolute Höchstwert im Vergleich der quantitativen Expression von Osteocalcin wird am siebten Versuchstag auf TICER mit 0,48 gemessen.

Die geätzte Oberfläche, die TiUnite-ähnliche-Oberfläche und Reintitan, bedingen am zehnten Versuchstag das jeweilige Maximum der BSP-Expression. Auf TICER findet man den Maximalwert für BSP schon am dritten Versuchstag, es folgen ein Abfall am fünften Tag und ein erneuter Anstieg auf 2,8 an Tag sieben. Der Wert wird auch am zehnten Tag gemessen. Ein deutlicher Abfall der BSP-Expression wird am Versuchstag sieben bei Reintitan ermittelt. Die BSP-Produktion auf der TiUnite-ähnlichen-Oberfläche ist über die gesamte Versuchsdauer auf einem hohen Niveau.

Experimentaloberflächen

Die Oberfläche Titan-Kalzium-Magnesium-ANOF erzeugt ein Maximum der Expression von Osteonectin bereits am siebten Versuchstag, am zehnten Versuchstag kommt es zu einem Rückgang des gemessenen Osteonectins.

Die Titan-Kalzium-Magnesium-Fluor-ANOF erzeugt am fünften Versuchstag ein Maximum der Osteonectinproduktion.

Die Expression von Osteonectin steigt bis zum zehnten Versuchstag für die Oberflächen Titan-Selen-ANOF an. Identische Expressionen werden am zehnten Versuchstag bei Titan-Kalzium-Magnesium-ANOF und Titan-Kalzium-Magnesium-Fluor-ANOF mit 0,16 erreicht.

Die Probekörper Titan-Selen-ANOF und Titan-Kalzium-Magnesium-Fluor-ANOF haben ein Maximum der Osteocalcinbildung am siebten Versuchstag.

Die BSP-Werte steigen auf Titan-Selen-ANOF, Titan-Kalzium-Magnesium-ANOF und Titan-Kalzium-Magnesium-Fluor-ANOF vom dritten Versuchstag bis zum zehnten Versuchstag an mit dem Maximum am zehnten Versuchstag.

Vergleich der Experimentaloberflächen mit den klinisch verwendeten Oberflächen

Die Osteonectinwerte auf der Titan-Selen-ANOF mit 0,2 sowie TICER und der TiUnite-ähnlichen-Oberfläche mit je 0,22 liegen am zehnten Versuchstag sehr eng beieinander. Die Expressionen von Osteocalcin auf den Oberflächen von Reintitan und Titan-Kalzium-Magnesium-ANOF erreichen am fünften Versuchstag Höchstwerte. Bei beiden Probekörpern kommt es am siebten Versuchstag zu einem deutlichen Abfall und am Versuchstag zehn zu einem minimalen Anstieg der Osteocalcinbildung.

Am zehnten Versuchstag erreicht ebenfalls TICER den höchsten Wert der Osteocalcinproduktion mit 0,35, gefolgt von der TiUnite-ähnlichen-Oberfläche mit 0,34, Titan-Kalzium-Magnesium-ANOF mit 0,31, Titan-Kalzium-Magnesium-Fluor-ANOF mit 0,30. Es folgen in absteigender Reihenfolge Titan-Selen-ANOF, Reintitan und die geätzte Oberfläche. Die Abbildungen 3 und 4 zeigen die entsprechenden Zellmorphologien. Man kann deutlich erkennen, dass sowohl die Anzahl der Zellen, die durch ihre leuchtend blauen Zellkerne zu bestimmen sind, als auch die rot markierte Expression von Osteocalcin vom fünften zum zehnten Tag in Kultur auf allen Oberflächen zunehmen. Die Morphologie und die Verteilung der Zellen auf den Probekörpern variieren stark. Auch die Größen der Zellkerne sind sehr unterschiedlich. Die Oberflächen Ti-Se und Ti-Mg scheinen vom fünften Versuchstag an eine größere Anzahl an Zellen und am zehnten Versuchstag auch besser strukturierte Zellverbände zu adhärieren. Damit werden die quantitativen Befunde auch durch den Augenschein bestätigt.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass bei vier Messzeitpunkten mit jeweils drei Parametern (BSP, Osteonectin und Osteocalcin) viermal auf Titan-Kalzium-Magnesium-Fluor-ANOF die jeweils höchsten Werte gemessen wurden, achtmal lagen die Werte über dem Durchschnitt für alle Probekörper. Die Werte für Titan-Kalzium-Magnesium-ANOF lagen ebenfalls achtmal über dem Durchschnitt.

Der höchste BSP-Wert wird am zehnten Tag auf Titan-Kalzium-Magnesium-ANOF mit 3,25 erreicht. Die geringste BSP-Expression am zehnten Tag wird auf der geätzten Oberfläche gemessen.

Diskussion

Die Bedeutung der Oberflächentopographie für die Osteoblastenantwort auf dem Implantatprobekörper wurde in zahlreichen Versuchen gezeigt. Oft erfolgte der Nachweis, dass mikrostrukturierte Oberflächen sowohl in vivo als auch in vitro deutliche Vorteile gegenüber maschinierten („glatten“) Oberflächen gleichen Materials aufweisen. Allerdings bestehen erhebliche Unterschiede in der Interpretation des Begriffes „Rau“, der einer quantitativen Bestimmung bei einigen klinisch verwendeten Oberflächentypen, ihrer unter sich gehenden Areale wegen nicht zugänglich ist.

Die zweite wesentliche Komponente für die Osteoblastenantwort auf die untersuchten Implantatoberflächen ist die chemische Zusammensetzung [19]. Knabe et al. [14] zeigten die Steigerung der Osteoblastendifferenzierung durch die Beschichtung mit Hydroxylapatit. Cooper et al. [5] erreichten durch Fluoridmodifikationen und Zreiquat et al. [21] durch Magnesiummodifikationen eine gesteigerte Osteoblastendifferenzierung.

Die hier vorgestellte Arbeit war als Pilotversuch mit wenigen Versuchwiederholungen ausgelegt. Bei der Betrachtung der Ergebnisse sind die Harmonie und der Verlauf der Kurven über die Versuchszeit wichtiger als einzelne, absolute Messwerte wie z. B. bei der geätzten Oberfläche, bei der das durchgehend niedrige Niveau der Proteinexpressionen verglichen mit dem der anderen Probekörper auffällt.

Aus dem zeitlichen Verlauf der Osteonectinexpression ergibt sich, dass die Modifikation der ANOF-Oberfläche mit Magnesium bzw. Magnesiumfluorid zu einer beschleunigten Organisation verglichen mit den Nachbildungen der klinisch eingesetzten ANOF-Oberflächen, TICER und der TiUnite-ähnlichen Oberfläche beiträgt. Diese Ergebnisse decken sich mit Untersuchungen von Zreiquat et al. [21], welche ebenfalls eine positive Wirkung von magnesiummodifizierten Oberflächen auf die Osteoblastenfunktion gezeigt haben.

Eine zusätzliche Fluoridbeigabe übt einen noch größeren Effekt auf die Osteonectinexpression aus, da bereits am fünften Versuchstag die Werte deutlich über den der anderen getesteten Oberflächen liegen. Auch Cooper et al. [5] erreichten eine gesteigerte Differenzierung von Osteoblasten durch Fluoridmodifikationen. Die Modifikation von Titan mit Magnesium- und Fluoridionen unter Anwendung der ANOF-Technik erscheint somit als viel versprechende Kombination, welche im vorliegenden Versuch eine vorteilhafte Wirkung auf die frühe Osteonectinproduktion zeigte.

Der stetige Anstieg der Osteonectinexpression auf den restlichen fünf Oberflächen könnte darauf hindeuten, dass die Organisation der extrazellulären Knochenmatrix auf den Probekörperoberflächen über den zehnten Versuchstag hinaus andauert. Die hohe Aktivität auf Titan-Kalzium-Magnesium-ANOF und Titan-Kalzium-Magnesium-Fluor-ANOF am fünften Versuchstag deutet auf die frühe Ausbildung der extrazellulären Matrix hin, die offensichtlich durch diese beiden Oberflächen begünstigt wird. Die Selen-Modifikation scheint hingegen keine zusätzliche Wirkung im Vergleich zu den etablierten ANOF-Oberflächen erzeugen zu können.

Erhöhte Osteocalcinkonzentrationen treten beim Knochenaufbau auf. Es wird angenommen, dass Osteocalcin die Hydroxylapatitbildung in der Knochenmatrix induziert. Dies würde bedeuten, dass besonders auf TICER und Titan-Kalzium-Magnesium-Fluor-ANOF am siebten Versuchstag bereits viele weit differenzierte Knochenzellen vorhanden sein müssten. Die Differenzierung auf den TiUnite-ähnlichen Oberflächen, Reintitan und Titan-Kalzium-Magnesium-ANOF und in geringerem Maß Titan-Selen-ANOF scheint vom fünften bis zum zehnten Versuchstag ähnlich fortgeschritten zu sein.

Der Rückgang der Osteocalcinmenge auf allen Oberflächen bzw. der nur noch geringe Anstieg auf TiUniteN könnte durch die Ausbildung eines Films von extrazellulärer Matrix auf rauen Oberflächen durch genügend viele Knochenzellen begründet werden. Diese würde zu einem Rückgang der Oberflächenrauheit führen. Somit ist der Anreiz zur weiteren Osteocalcinsekretion nicht mehr vorhanden, denn eine erhöhte Rauheit der Oberfläche wurde von vielen Autoren [2, 3, 17] mit gesteigerter Osteocalcinproduktion in Verbindung gebracht. Die Fähigkeit von BSP, an Hydroxylapatitkeime in vitro zu binden [12], zusammen mit dem Auftreten während der frühen Mineralisationsphase des Knochengewebes [4], lässt vermuten, dass es eine wichtige Rolle bei der Initialisierung der Mineralisierung von Geweben in vivo hat [12]. Also könnte auf den klinisch eingesetzten ANOFs TICER und der TiUnite-ähnlichen Oberfläche bereits am Anfang der Untersuchung, am dritten Versuchstag, ein deutlicher Vorteil beim Anlegen von Mineralisationskeimen bestehen. Interessant ist weiterhin, dass die Experimentaloberflächen Titan-Kalzium-Magnesium-ANOF und Titan-Kalzium-Magnesium-Fluor-ANOF erst am Ende des Versuchszeitraumes eine hohe Expression von BSP erreichen, und wie mehrfach beobachtet, ähnliche Kurvenverläufe zeigen, wie auch Titan-Selen-ANOF. Die Modifikation des Titangrundkörpers mit Selen erbrachte in keiner Untersuchung einen wesentlichen Vorteil im Vergleich zu den restlichen Oberflächen.

Nach Auswertung der Ergebnisse dieses In-vitro-Versuches ist die hier untersuchte geätzte Oberfläche als zytotoxisch zu bezeichnen. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zur allgemein anerkannten Meinung, dass die erhöhte Rauheit einer Oberfläche die Osteoblastenproliferation und vor allem -differenzierung in vitro begünstigt [16]. Klinisch haben raue Oberflächen vor allem den Vorteil, dass der Verbund zwischen Implantat und Knochen erhöht ist. Dieser Aspekt ist ein wesentliches Kriterium für die frühe Belastbarkeit des Implantat-Knochen-Verbundes und damit für den klinischen Erfolg eines Implantattyps. In der Literatur gibt es Untersuchungen, welche die Rauheit und damit die Porengröße genauer untersuchten und bei Veränderungen der Oberflächenmorphologie auch Veränderung der Osteoblastenantwort nachwiesen. Zinger et al. [20] zeigten, dass die Größe der Mikroporen auf der Implantatoberfläche einen wesentlichen Einfluss auf Wachstum und Anheftung der Osteoblasten haben. Eine mögliche Erklärung für das schlechte Ergebnis der geätzten Oberfläche könnte eine nachteilige Porengröße sein. Es wurde gezeigt, dass eine Porengröße von 100 µm die besten Ergebnisse liefert [20]. Die Poren auf unserer geätzten Oberfläche messen 2 µm. Allerdings konnten wir eine verminderte Proliferation und Differenzierung der enoralen Knochenzellen auch an originalen SLA-Oberflächen sehen [10].

Die Diskrepanz zwischen unseren in vitro Versuchen und der klinischen Erfahrung ließe sich erklären, wenn man die Existenz mehrerer Patho-Mechanismen, welche zur Osseointegration und somit zum klinischen Erfolg führen, postulierte [11]. Während einige Oberflächenmodifikationen offenbar eine Osseointegration durch zelluläre Reaktionen bedingen, wäre für subtraktiv bearbeitete Oberflächen die Einheilung über einen azellulären Weg denkbar. Dabei würde die Einscheidung des Implantatkörpers durch Kalzium- und Phosphationen aus der Umgebung ohne die Beteiligung von Zellen erfolgen. Diese Ionen müssten sich nach Anlagerung an die Implantatoberfläche in kristalline Strukturen umwandeln. Folgt man diesem Gedankengang weiter, würden die subtraktiv bearbeiteten Oberflächentypen folglich nicht durch den biogenen Mineralisationstyp „Osteoneogenese“ biologisch sondern durch physikalisch-chemische Reaktionen einheilen. Bei dieser Überlegung müssten wir davon ausgehen, dass unsere Versuchsmethode ungeeignet für subtraktiv bearbeitete Oberflächen ist, da als Messgrößen ausschließlich Proteine dienen, wie sie bei zellulär bedingten Einheilmechanismen vorkommen.

Ein weiterer Ansatz ist, dass die Knochenzellproliferation auf subtraktiv erzeugten Oberflächen zu einem späteren Zeitpunkt erfolgt. Das würde aller Wahrscheinlichkeit nach aber bedeuten, dass die subtraktive Oberflächenmodifikation zu einer langsameren Osseointegration in vivo führt. Diese Hypothese wird jedoch durch klinische Beobachtungen nicht bestätigt.

Im Gegensatz dazu zeigen die klinisch etablierten und durch den Herstellungsprozess verwandten TICER und die TiUnite-ähnliche Oberfläche fast durchweg gute bis sehr gute Ergebnisse. TICER ermöglicht eine besonders hohe Osteocalcinexpression am siebten Versuchstag und eine von Beginn an hohe Konzentration von BSP. Das zeigt, dass auf dieser Oberfläche eine zeitige Differenzierung von Knochenzellen, frühe Hydroxylapatitkeimbildung und Initialisierung der Mineralisation möglich ist.

Interessant waren auch die Ergebnisse, welche die maschinierte Reintitan-Oberfläche hervorbrachte. Reintitan sollte in unserem Versuch als Negativstandard dienen. Jedoch ergaben die meisten Messungen durchschnittliche Werte. Bei der Osteonectinexpression am zehnten Versuchstag erreichte Reintitan sogar den höchsten gemessenen Wert der gesamten Versuchsreihe. Die Oberfläche war nicht glatt, sondern hatte durch die Maschinenbearbeitung eine gerillte Oberfläche.

Eine mögliche Erklärung liefern Schneider et al. [18]. Sie zeigten dass die Mikrotopographie einen entscheidenden Einfluss auf die Osteoblastenproliferation hat. In der genannten Arbeit kamen wie in unserem Versuch gerillte Oberflächen zum Einsatz. Es wurde gezeigt, dass die Osteoblastenproliferation und -anhaftung auf rauer und gerillter Oberfläche annähernd gleich waren. Die Knochenzellen nutzen die Rillen anscheinend als Leitschiene zur Anhaftung und Orientierung.

Die Oberflächen Titan-Kalzium-Magnesium-ANOF und Titan-Kalzium-Magnesium-Fluor-ANOF zeigen zu den meisten Messzeitpunkten gute bis sehr gute Ergebnisse. Die beschriebenen Ergebnisse machen weitere Untersuchungen mit Magnesium und Fluoridmodifikationen empfehlenswert.

Wir stellen hier ein Verfahren vor, dass nicht auf der Zählung der Anzahl angehefteter Zellen an der Implantatoberfläche beruht. Diese Zählungen sind im Rahmen einer Promotionsarbeit durchgeführt worden. Die Zellanzahlen korrelieren mit den Grauwerten der Marker-Expression. Man kann also bei hohen Proteinexpressionen von hohen Proliferationsraten ausgehen. Die Zellzählungen als interaktive Verfahren sind jedoch sehr zeitaufwendig. Die Expressionsmessungen als Grauwerte gestatten eine automatische Auswertung und Speicherung und damit einen hohen Durchsatz bei der Probekörperprüfung. Somit werden die gängigen Anforderungen an ein Screening im Sinne einer Vorauswahl erfüllt.

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Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Heidegard Hilbig

Institut für Anatomie

Universität Leipzig

Liebigstr. 13

04103 Leipzig,

Tel: 03 41 / 9 72 20 53

Fax: 03 41 / 9 72 20 09

E-Mail: hilbigh@medizin.uni-leipzig.de

Fussnoten

1 Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie,
Universitätsklinikum Leipzig, Nürnberger Str. 57, 04103 Leipzig,

2 Technische Universität Chemnitz, Institut für Chemie,
Strasse der Nationen 62, 09107 Chemnitz

3 Institut für Anatomie, Liebigstr. 13, 04103 Leipzig

* Die vorliegende Arbeit wurde von der Fa. ZL-Microdent Attachment GmbH & Co. KG, Breckenfeld, im Rahmen des Projektes Osteokompatibilitäts-Screening unterstützt.


(Stand: 27.04.2011)

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