Zellwachstum auf unterschiedlich strukturierten Zirkoniumdioxid- und Titan-Oberflächen: eine morphologische In-vitro-Untersuchung

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M. Payer1, M. Lorenzoni2, N. Jakse3, R. Kirmeier4, G. Dohr5 , M. Stopper6, C. Pertl7

Zielsetzung: Ziel dieser Studie war die Beurteilung des Zellwachstums von menschlichen Osteoblasten und Fibroblasten auf unterschiedlichen Zirkoniumdioxid- und Titan-Oberflächenstrukturen mit vergleichbaren Rauigkeitswerten.

Materialien und Methoden: Fünf Oberflächenstrukturen wurden untersucht: Titan gedreht (Ti m), Titan sandgestrahlt und säuregeätzt (Ti g+e), Zirkoniumdioxid unbehandelt (ZrO2 m), Zirkoniumdioxid sandgestrahlt (ZrO2 g) und Glasobjektträger (Gl. kontr.). Sowohl Osteoblasten als auch Fibroblasten wurden unter statischen Bedingungen kultiviert, Osteoblasten auch unter dynamischen Bedingungen. Die Morphologie wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) beurteilt; Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) wurde eingesetzt, um Zellzahlen über einen Zeitraum von fünf Tagen zu bestimmen. Als Marker-Substanzen für die Zelldifferenzierung wurde die Sekretion von Kollagen Typ I und alkalischer Phosphatase (ALP) nach 48 und 96 Stunden verwendet.

Ergebnisse: Zellen hefteten sich an alle Oberflächen an. Unter statischen Bedingungen zeigten die Zellzahlen beider Zelllinien keinen signifikanten Unterschied. Unter dynamischen Bedingungen waren am ersten und zweiten Tag signifikant höhere Anzahlen von Osteoblasten auf ZrO2 g- und Ti g+e-Oberflächen als auf Ti m-, ZrO2 m- und Glas-Oberflächen vorhanden. Kollagen- und ALP-Sekretion nach 48 h konnte nur bei den Oberflächen Ti g+e und ZrO2 g festgestellt werden. Die durchschnittlichen Rauigkeitswerte (Ra) von Ti g+e und ZrO2 g waren signifikant höher als diejenigen von ZrO2 m-, Ti m- und Gl. kontr.-Oberflächen.

Schlussfolgerungen: Innerhalb der Grenzen von In-vitro-Ergebnissen scheint sich die Oberflächenrauigkeit bei Zirkoniumdioxid als Implantatwerkstoff ebenso vorteilhaft für das initiale Zellwachstum und den Stoffwechsel auszuwirken, wie dies für Titan festgestellt wurde.

Schlagwörter: Oberflächenstruktur; Zirkoniumdioxid; Y-TZP; Zellwachstum

Einleitung

Gegenwärtig ist Reintitan (Grad 1 bis 4, ASTM) der Werkstoff der Wahl für die zahnärztliche Implantologie. Seine mechanischen und biologischen Eigenschaften sind gut dokumentiert und haben sich als zufriedenstellend bewährt [1, 11, 24]. Allerdings haben der graue Farbton von Titanimplantaten, der zu Verfärbungen der periimplantären Schleimhaut führen kann [21, 57], und eine steigende Nachfrage nach metallfreien Implantaten die Suche nach Alternativen zu Titan in der Implantologie gefördert. Darüber hinaus ist in letzter Zeit die Biostabilität von Titan zunehmend infrage gestellt worden [46, 51, 53–55]. Überempfindlichkeiten und Allergien gegenüber Titan wurden diskutiert, bisher gibt es aber keine Belege für ihre klinische Relevanz [56].

Zirkoniumdioxid (ZrO2, „Zirkon“, engl. “zirconia”) hat sich als inertes, nicht-resorbierbares und biokompatibles Metalloxid erwiesen [39]. Es besitzt gute chemische und physikalische
Eigenschaften, etwa eine hohe Biegefestigkeit (900–1200 MPa), Härte (1200 Vickers), einen Weibull-Modul von 10–12, Risszähigkeit von 8 Mpa ?m KIc und geringes Korrosionspotenzial [19, 35, 52]. Zirkoniumdioxid, in der Regel erhältlich als 3–5 M % Yttrium-stabilisierter tetragonaler Polykristall (Y-TZP) [26], wurde zunächst in der orthopädischen Chirurgie für Gelenkköpfe in der Hüft-Totalendoprothetik eingesetzt. Die Minimal-anforderungen für seinen Einsatz als Werkstoff für zahnärztliche Implantate sind in der ISO-Norm 13356 aufgeführt [13]. Im Vergleich mit früheren Implantaten aus Aluminiumoxidkeramik, die aufgrund hoher Frakturanfälligkeit bei klinischer Anwendung vom Markt genommen werden mussten, scheint Zirkoniumdioxid das Potenzial einer Alternative zu Titan zu besitzen [28, 44, 47]. Verbesserungen bei der Materialfestigkeit bei Y-TZP haben die erfolgreiche klinische Anwendung von Abutments, Kronen und Brücken aus Zirkoniumdioxid beim Menschen ermöglicht [7, 18, 33, 42, 58]. Allerdings konnten verschiedene Eigenschaften von Y-TZP im klinischen Einsatz als Implantatwerkstoff bislang nicht im Detail untersucht werden.

Zu diesen Eigenschaften gehört die Anfälligkeit für Abbauvorgänge bei niedrigen Temperaturen und beschleunigte Materialalterung in feuchter Umgebung und bei niedrigen Temperaturen (150–400 °C); die Auswirkungen des Ersatzes von Yttriumoxid durch andere stabilisierende Oxide (z. B. Ceriumoxid, Aluminiumoxid) [13, 26], die langfristigen Auswirkungen intraoralen Beschleifens von momentan in der Regel einteiligen Y-TZP-Implantaten [12, 20, 30, 33]; und die Rolle von Oberflächenstrukturen und Rauigkeit bei der Gewebereaktion auf Y-TZP [2–4]. In experimentellen und Tiermodellen hat sich Y-TZP als biokompatibel und empfänglich für Osseointegrationsvorgänge [16, 17, 23, 25, 27, 28, 34, 41, 45, 48, 49, 50], sowie zur Knochenneubildung an aufgerauten Oberflächenstrukturen erwiesen.

Die Mechanismen der Protein-Adsorption bei Titan und Y-TZP scheinen sich jedoch zu unterscheiden. Rezwan et al. kamen zu dem Schluss, dass bei Y-TZP in vitro hydrophobe Wechselwirkungen verantwortlich für eine hohe Adsorption von Albumin und Lysozym waren, während die Protein-Adsorption bei Titan vor allem von elektrostatischen Kräften verursacht zu sein scheint [41].

In-vitro-Ansätze unter Verwendung von Zellkulturmodellen haben vergleichbare Zellproliferation und Proteinsynthese von Osteoblasten gezeigt, die auf Zirkoniumdioxid-Proben oder in Kontrollgruppen auf Deckgläsern kultiviert wurden [25]. Für Titan haben In-vivo- [27] und In-vitro-Studien [34] vorteilhafte Auswirkungen von Oberflächenrauigkeit auf frühe Knochenbildung und Zelldifferenzierung – gemessen anhand der Sekretion von Kollagen Typ I, alkalischer Phosphatase, Osteocalcin und der Freisetzung lokaler Faktoren (TGF-?1 and PgE2) – gezeigt. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Oberflächenenergie, Hydrophilie und Oberflächentopographie die Osteoblastendifferenzierung positiv beeinflussen [59]. Kollagen vom Typ I und die alkalische Phosphatase sind als verlässliche Markersubstanzen der Zelldifferenzierung und des Stoffwechsels bekannt [14, 32, 34].

In einer umfangreichen Übersichtsarbeit zu den klinischen Auswirkungen der Oberflächeneigenschaften oraler Implantate berichten Albrektsson and Wennerberg über eine signifikant schnellere Knochenanlagerung an Implantatoberflächen mit Ra-Werten von etwa 1,5 µm verglichen mit Oberflächen, die Ra-Werte < 1,0 µm aufweisen [5–6]. Auch Tiermodelle weisen auf ähnliche Wirkungen aufgerauter Y-TZP-Oberflächenstrukturen hin. Leider wurden in vielen Studien entweder Y-TZP-Oberflächen mit Ra-Werten < 1 µm mit Titan-Oberflächen mit Ra-Werten > 1 µm verglichen, oder es waren keine näheren Informationen zur Rauigkeit der Oberflächen beim Vergleich der beiden Materialien angegeben [12, 15, 17]. Dementsprechend gibt es nur wenige Informationen über den Einfluss unterschiedlicher Zirkoniumdioxid-Oberflächengestaltungen auf die zelluläre Antwort von Osteoblasten und Fibroblasten.

Die vorliegende In-vitro-Untersuchung wurde durchgeführt, um Informationen zum initialen zellulären Verhalten menschlicher Osteoblasten und Fibroblasten auf unterschiedlichen Y-TZP- und Titan-Oberflächenstrukturen mit Rauigkeitswerten zu erhalten, die denjenigen von bewährten Titan-Oberflächen in der klinischen Anwendung entsprechen [5–6, 37]. Ein Zellkulturmodell wurde eingesetzt, um zusätzliche Daten über die Anheftung von Osteoblasten in einer dynamischen Umgebung zu gewinnen.

Materialien und Methoden

Prüfkörper und Oberflächengestaltung

Fünf experimentelle Substrate mit unterschiedlichen Oberflächenstrukturen wurden untersucht: Titan gedreht (Ti m), Titan sandgestrahlt and säuregeätzt (Ti g+e), Zirkoniumdioxid unbehandelt (ZrO2 m), Zirkoniumdioxid sandgestrahlt (ZrO2 g) und Glasobjektträger als Kontrolle (Gl. kontr.) (Abb. 1 a–g). Die Prüfkörper hatten einen Durchmesser von 10 mm und eine Dicke von 3 bis 4 mm. Die Oberflächenbearbeitung wurde analog zur Gestaltung von Implantatoberflächen durchgeführt: Drehen, Sandstrahlen mit TiO2-Partikeln und Säureätzung (HCl/H2SO4 ). Die Messungen der durchschnittlichen Oberflächenrauigkeit wurden mittels Profilometrie durchgeführt (Dektak 150, Veeco, Tucson, USA). Zur morphologischen Untersuchung verschiedener Oberflächenstrukturen wurde ein Rasterelektronenmikroskop (REM; ZEISS, DSM 950, Oberkochen, Deutschland) verwendet. Vor der Kultivierung der Zellen wurden die Scheibchen im Ultraschallbad gereinigt und bei 120° C sterilisiert.

Beschreibung der Zelllinien

Es wurden zwei ATCC-registrierte Zelllinien menschlicher Osteoblasten und Fibroblasten eingesetzt.

Osteoblasten (hFOB 1.19, ATCC Nr.: CRL-11372):

Menschliche fetale Osteoblasten, transfiziert mit großem SV-40-T-Antigen, mit einem zu 43 % diploiden und zu 57 % tetraploiden Karyotyp, adhärenten Wachstumseigenschaften und der Fähigkeit, Kollagen vom Typ I zu produzieren.

Fibroblasten (Detroit 551 ATCC Nr.: CCL-110):

Menschliche fetale Fibroblasten weiblichen Geschlechts, kaukasischer Ethnizität, reverse-Transkriptase-negativ und mit dem normalen menschlichen weiblichen diploiden Karyotyp.

Kultur menschlicher Osteoblasten und Fibroblasten

Die Osteoblasten (hFOB 1.19, ATCC Nr.: CRL-11372) wurden kultiviert in einer 1:1-Mischung von Dulbeccos Modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, PAA, Pasching, Österreich) ohne Phenolrot und Hams F12-Medium (PAA, Pasching, Österreich) mit 2,5 mM L-Glutamin in 75-cm2-Gewebekulturflaschen. Hinzugefügt wurden 10 % FBS (fetales bovines Serum; PAA, Pasching, Österreich) und 1 % Penicillin/Streptomycin mit
0,3 mg/ml Gentamycin–Sulfat.

Die Fibroblasten (Detroit 551 ATCC Nr.: CCL-110) wurden ebenfalls in 75-cm2-Gewebekulturflaschen in Eagles Minimum Essential Medium mit 2 mM L-Glutamin und 2,2 g/l Natriumhydrogenkarbonat (Bertoni, Wien, Österreich) kultiviert. 10 % FBS (fetales bovines Serum; PAA, Pasching, Österreich), 1 % Natrium-Pyruvate, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren und 1 % Penicillin/Streptomycin wurden hinzugefügt.

Osteoblasten und Fibroblasten wurden in 5 % CO2 bei 37 °C über drei bis fünf Tage inkubiert, bis die Zellen Konfluenz zeigten. Das Nährmedium wurde alle 48 Stunden ausgetauscht. Die Zellen wurden mittels Accutase (PAA, Pasching, Österreich) aus den Gewebekulturflaschen entnommen. Eine Teilmenge der Zellsuspension wurde entnommen und die Zahl der Zellen berechnet.

Beurteilung von Zellanheftung, Morphologie
und Phänotyp

Um festzustellen, ob die Zellanheftung und Morphologie durch den Probenwerkstoff (Zirkoniumdioxid oder Titan) und die Oberflächengestaltung beeinflusst werden, wurden die Fibroblasten und Osteoblasten auf den Proben kultiviert und mittels REM beurteilt.

25 Scheibchen (fünf jedes Oberflächentyps) mit 2 x105 Zellen in 150 µl Nährmedium pro Probe und Oberfläche wurden vorbereitet und 48 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 bebrütet.

Nach der Inkubationszeit wurden die Scheibchen aus den Gewebekulturflaschen entnommen, zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, PAA, Pasching, Österreich) abgespült und mit 2 % Paraformaldehyd und 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 mol Kakodylat-Puffer bei Zimmertemperatur 15 Minuten lang fixiert. Anschließend erfolgten zwei Wässerungsschritte in Kakodylat-Puffer, Entwässerung mittels aufsteigender Alkoholreihe und Kritischer-Punkt-Trocknung. Die Scheibchen wurden mithilfe eines MED 010 (Oerlikon Balzers Coating, Balzers, Liechtenstein) mit Goldpartikeln besputtert und anschließend unter dem REM betrachtet.

Wie von Rajaraman beschrieben, lassen sich vier verschiedenartige Erscheinungsbilder von Zellphänotypen in den verschiedenen Phasen der Differenzierung und fortschreitenden Anheftung von Zellen aus Suspensionen (Osteoblasten und Fibroblasten) auf Oberflächen beobachten [40, 43].

Zellen im Stadium 1 zeichnen sich durch runde Zellkörper mit beginnendem Kontakt durch Filopodien aus, Zellen im Stadium 2 durch fokale zytoplasmatische Fortsätze (Lamellipodien). In Stadium 3 beginnt das Zytoplasma sich zwischen den Lamellipodien auszubreiten, die Zellen bekommen eine flache Form. Stadium-4-Zellen sind vollständig ausgebreitet und weisen eine flache, polygonale Form auf (Abb. 1, 2a–g).

Quantifizierung der unter statischen und
dynamischen Bedingungen kultivierten Zellen

Ähnlich dem Vorgehen zur Kultivierung für die REM-Untersuchung wurden Osteoblasten und Fibroblasten auf alle Oberflächen aufgebracht, in einer Konzentration von 5x104 Zellen in 150 µl des Kulturmediums pro Scheibchen (15 Scheibchen jedes Oberflächentyps). Nach einer Inkubationszeit von drei bis vier Stunden – um eine erste Zelladhäsion an der Oberfläche zu ermöglichen – wurde jede Probe mit zwei Millilitern des Nährme-
diums bedeckt. Osteoblasten und Fibroblasten wurden unter statischen, Osteoblasten außerdem unter dynamischen Bedingungen (40 Bewegungen/min) auf einem Minirüttler (MS2, IKA, Staufen, Deutschland) bei 37 °C und 5 % CO2 über 96 Stunden inkubiert.

Die Zellkerne wurden unmittelbar vor der Beobachtung unter dem Laser-Scanning-Mikroskop (LSM, TCS-SP2, Leica, Bensheim, Deutschland) mit einem fluoreszierenden Farbstoff (Cell Tracker Green CMFDA; Molekularsonden, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) angefärbt. Die Scheibchen wurden aus den Petrischalen herausgenommen, mit serumfreiem Medium abgespült, 15 Minuten mit Färbelösung bei 37 °C inkubiert und anschließend dreimal mit serumfreiem Medium abgespült. Für das abschließende Waschen wurde, um alle verbliebenen Reste zu entfernen, PBS verwendet. Für alle LSM-Untersuchungen wurden Glasobjektträger als Negativkontrollen eingesetzt.

Untersuchungen fanden nach drei Stunden (in Abb. 2 nicht dargestellt), 24 h, 48 h, 72 h und 96 h (Abb. 2a–d) statt.

Die Zellen wurden pro Sichtfeld im LSM in fünf durch das Gitter definierten Feldern ausgezählt (Mitte, Oben, Unten, Rechts und Links). Die Gesamtzahl wurde durch fünf dividiert und damit die durchschnittliche Zellzahl pro Sichtfeld berechnet.

Dieser Ablauf wurde bei sämtlichen oben aufgeführten Zeitpunkten eingehalten, um die Zunahme der Zellen während des Untersuchungszeitraums auf allen untersuchten Oberflächen vergleichen zu können.

Beurteilung der Osteoblastendifferenzierung

Als Marker für die Osteoblastendifferenzierung wurde die Sekretion von Typ-1-Kollagen und alkalischer Phosphatase nach 48 und nach 96 Stunden auf allen Oberflächen bestimmt (15 Scheibchen je Oberflächentyp).

Zur Feststellung der Sekretion von Kollagen Typ I wurde ein primärer Antikörper (MAB3391, 1 mg/ml, Chemicon, Temecula, Kalifornien, USA) appliziert und eine Stunde lang inkubiert. Anschließend wurde ein sekundärer Antikörper (AB Cy2-GaM 1,5 mg/ml, Dianova, Hamburg, Deutschland) zugegeben. Um Zellen von Sekretionsprodukten unterscheiden zu können, erfolgte für jede Oberfläche eine weitere Anfärbung der Zellkerne (Cell Tracker Green CMFDA; Molekularsonden, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) auf die zuvor beschriebene Weise in Verbindung mit einer Anfärbung des Kollagens (Abb. 4a–d). Die ALP-Aktivität wurde mithilfe eines Tests für die alkalische Phosphatase (Sigma Aldrich, Wien, Österreich) festgestellt und mittels Hellfeldmikroskopie visualisiert. Erneut dienten Glasobjektträger als Negativkontrollen.

Statistische Analyse

Für alle Zellzahlen wurde ein Kolmogorov-Smirnov-Anpassungstest durchgeführt, um den Typ der Werteverteilung zu überprüfen. Die Zunahme der Zellen über 96 Stunden auf unterschiedlichen Oberflächen wurde mit einem Verallgemeinerten Linearen Modell (GLM) mit wiederholter Messung bestimmt. Zum Vergleich verschiedener Gruppen (Oberflächentypen) zu bestimmten Zeitpunkten wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey-post-hoc-Test berechnet. Die Ra-Werte wurden mithilfe einer einfachen ANOVA verglichen. Werte mit p < 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.

Ergebnisse

Analyse der Proben und der Oberflächengestaltung

Die gedrehte Titan-Oberfläche (Ti m) erscheint glatt mit Graten unregelmäßiger Höhe und Abständen voneinander (3 µm bis 6 µm). Die sandgestrahlte und säuregeätzte Oberfläche (Ti g+e) weist eine raue Morphologie mit Poren und Gipfeln homogener und mikroporöser Struktur auf. Die Poren sind unregelmäßig abgerundet, haben etwa 3 bis 5 µm im Durchmesser und sind etwa 2 bis 3 µm tief.

Die Zirkoniumdioxid-Prüfkörper weisen ebenfalls einen Unterschied zwischen unbehandelten (glatt) (ZrO2 m) und sandgestrahlten Oberflächen (ZrO2 g) auf. ZrO2 g zeigte eine unregelmäßige Mikrostruktur mit Gipfeln und Tälern ähnlicher Abmessungen wie bei der sandgestrahlten und säuregeätzten Titan-Oberfläche (Ti g+e). Die gefräste Zirkoniumdioxid-Oberfläche (ZrO2 m) war eher glatt und homogen mit Graten unregelmäßiger Höhe (Abb. 1 a bis h).

Die profilometrischen Ergebnisse für die Oberflächen Ti m (Ra 0,37 µm; min. 0,30, max. 0,42, SD 0,04) und ZrO2 m (Ra 0,39 µm; min. 0,28, max. 0,52, SD 0,09) zeigten untereinander keinen signifikanten Unterschied bei der mittleren Rauigkeit (p > 0,05), jedoch hochsignifikant (p < 0,001) niedrigere Ra-Werte als die Oberflächentypen Ti g+e (Ra 1,43 µm; min. 1,29; max. 1,51, SD 0,076) und ZrO2 g (Ra 1,41 µm; min.1,3, max. 1,5, SD 0,03). Die Oberflächenstrukturen von Ti g+e und ZrO2 g zeigten keinen signifikanten Unterschied bei der Rauigkeit (p > 0,05). Die Ra-Werte von Gl. kontr. (Ra 0,08 µm; min. 0,06, max. 0,1, SD 0,01) waren signifikant niedriger (p < 0,001) als die aller anderen Oberflächen (Tab. 1).

Beurteilung von Zellanheftung, Morphologie
und Phänotyp

Sowohl Osteoblasten als auch Fibroblasten hafteten auf allen untersuchten Oberflächen und ihre Anzahl wuchs vom ersten bis zum fünften Tag. Zellen beider Linien erschienen als menschliche Osteoblasten und Fibroblasten ohne jegliche Anzeichen für Missbildungen (Abb. 1a–h). Alle von Rajaraman beschriebenen Stadien der Zellreifung und fortschreitenden Anheftung von Zellen aus Suspensionen auf Oberflächen konnten unterschieden werden [40]. Es waren keine vom Werkstoff abhängigen, wohl aber klare von der Struktur der Oberflächen abhängige Unterschiede in der Zellform erkennbar. Zellen auf gefrästen Oberflächen Ti m und ZrO2 m waren allgemein von flacher Gestalt mit wenigen Ausläufern (Stadium 3), wohingegen Zellen auf den Oberflächen Ti g+e and ZrO2 g eine polygonale Form mit mehr Ausläufern und an Oberflächenstrukturen angehefteten Filopodien aufwiesen (Stadium 4) (Abb. 1c, d, g).

Auf den beiden Oberflächen Ti g+e und ZrO2 g konnte eine große Zahl von Osteoblasten mit globulären Strukturen beobachtet werden, möglicherweise ein Anzeichen für sekretorische Aktivität (Abb. 1c–d).

Quantifizierung der unter statischen Bedingungen kultivierten Zellen

Bei beiden Zelllinien trat eine hochsignifikante Zunahme der Zellzahlen im Beobachtungszeitraum auf (p < 0,0001), unabhängig von Werkstoff und Oberflächentyp. Unabhängig von der Oberflächenstruktur gab es keine signifikanten zahlenmäßigen Unterschiede (p > 0,05), weder für Osteoblasten noch für Fibroblasten zwischen Titan und Zirkoniumdioxid als Unterlage oder den Glas-Kontrollen (Abb. 2a–d, 3a–b).

Quantifizierung der unter dynamischen Bedingungen kultivierten Osteoblasten

Nach dem ersten und zweiten Tag waren die Zellzahlen auf allen Oberflächentypen signifikant niedriger (p < 0,001) als die ursprünglich aufgebrachte Zellkonzentration am Tag Null. Darüber hinaus fanden sich nach dem ersten und zweiten Tag signifikant weniger Zellen auf den Oberflächen Ti m, ZrO2 m und Gl. kontr. als auf Ti g+e und ZrO2 g (p < 0,01). Zwischen dem ersten und dem vierten Tag nahmen die Zellen erneut auf allen Oberflächentypen zu. Nach dem dritten und dem vierten Tag waren auf den ZrO2 g-Scheibchen signifikant mehr Zellen vorhanden als auf den Gl. kontr. (p < 0,01) (Abb. 3c).

Beurteilung der Osteoblastendifferenzierung

Die Anfärbung von Typ-I-Kollagen und ALP zeigte deutliche Sekretion beider Marker auf den Oberflächentypen Ti g+e und ZrO2 g nach 48 Stunden, dagegen gab es auf den Oberflächentypen Ti m, ZrO2 m und Gl. kontr. keine Belege für sekretorische Aktivität. Nach 96 Stunden zeigte die Anfärbung der Proben auch Kollagen- und ALP-Sekretion auf den Oberflächentypen ZrO2 m, Ti m und Gl. kontr. (Abb. 4a–d).

Diskussion

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen vergleichbares Zellwachstum von menschlichen Osteoblasten und Fibroblasten auf Zirkoniumdioxid-Probekörpern unterschiedlicher Oberflächenstruktur und Rauigkeit wie das Zellwachstum auf vergleichbaren Titan-Oberflächen. Oberflächenstruktur und Rauigkeit scheinen entscheidende Faktoren für Y-TZP als Implantatmaterial darzustellen [45, 23]. Für Titan-Implantate gaben Albrektsson und Wennerberg eine optimale durchschnittliche Oberflächenrauigkeit (Ra) von etwa 1,5 µm im Hinblick auf die Gewebeantwort an [5–6]. In einer Tierversuchsstudie berichtete Sennerby über signifikant höhere Ausdrehmomentwerte (RTQ) für Y-TZP-Implantate mit modifizierter Oberfläche (ZrA Ra: 0,93 µm und ZrB Ra: 1,24 µm) als für Y-TZP-Implantate ohne Oberflächenmodifikation (Zr-Ctr Ra: 0,75 µm) nach sechs Wochen in Femur und Tibia von Kaninchen. Sie stellten insgesamt keine signifikanten Unterschiede für Knochen- Implantat-Kontakt (BIC) fest, jedoch signifikant höhere BIC-Werte für die besten drei Implantatgewindegänge von ZrA verglichen mit Zr-Ctr. Eine TiUnite Oberfläche (Nobel Biocare AB, Göteborg, Schweden) mit Ra 1,30 µm diente als Kontrolle [49].

Neuere Studien über Y-TZP als Implantatmaterial verwendeten keine Implantate und Proben mit Ra-Werten von 1–1,5 µm [3, 29] zum Vergleich mit üblichen Titan-Oberflächen. Bächle et al. verglichen das Verhalten osteoblastenähnlicher Zellen auf Y-TZP-Proben mit durchschnittlichen Oberflächenrauigkeitswerten von Ra 0,15 µm, 0,85 µm und 0,91 µm mit einer SLA-Oberfläche (Straumann AG, Waldenburg, Schweiz), mit Ra 1,2 µm und einer Polystyrol-Oberfläche mit Ra 0,02 µm. Sie berichteten über von Werkstoff oder Rauigkeit der Unterlage unabhängiges Zellwachstum, Morphologie and Anheftung an Probekörper in einer Kultur über einen Zeitraum von zwölf Tagen. Die Zelldifferenzierung wurde nicht beurteilt [12].

Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen beobachteten Zhao et al. deutliche Veränderungen der Zellform von Osteoblasten, Anheftung und Differenzierung im Zusammenhang mit steigenden Werten für Rauigkeit und Oberflächenenergie auf Titan. Außerdem fanden sie eine signifikante Zunahme der Faktoren für die Zelldifferenzierung (alkalische Phosphatase, Osteocalcin) und der Produktion lokaler Faktoren (TGF-b1, PGE2, Osteoprotegerin (OPG)) bei steigender Oberflächenrauigkeit und Oberflächenenergie [59].

Bisher gibt es keine verlässlichen In-vitro-Daten für Y-TZP-Oberflächen einer durchschnittlichen Oberflächenrauigkeit von 1 µm bis 1,5 µm. Die vorliegende Studie war als Vorläufer einer kontrollierten klinischen Studie konzipiert. In ihr wird ein einfaches In-vitro-Modell zur Untersuchung einer experimentellen sandgestrahlten Y-TZP-Oberfläche (ZrO 2 s) mit einer mittleren Rauigkeit (Ra) von 1,41 µm und einer gefrästen Y-TZP-Oberfläche mit Ra 0,39 µm im Vergleich mit Titan-Oberflächen entsprechender Rauigkeit (p < 0,05) im Hinblick auf Zellwachstum und Differenzierung verwendet. Ein Versuchsaufbau zur Zellkultur bei Bewegung wurde einbezogen, um zusätzliche In-vitro-Daten über die Zellanheftung auf unterschiedlichen Oberflächenstrukturen zu erhalten. Außerdem wurde die Anfärbung von Kollagen Typ I und ALP als Marker der Osteoblastendifferenzierung eingesetzt. Die Zellmorphologie nach 48 Stunden Kultivierung zeigte, dass sich Zellen beider Linien an allen Oberflächentypen anhefteten. Die Zellen auf den glatten Oberflächen Ti m, ZrO2 m, Gl. kontr. wiesen flache Form mit wenigen Ausläufern auf, dagegen waren Zellen auf den Oberflächen Ti g+e und ZrO2 g Polygone mit mehr Ausläufern und Filopodien als Zeichen intensiver Anheftung und stärkerer Zelldifferenzierung. Diese Resultate stehen im Einklang mit In-vitro-Studien über Titan-Oberflächen, die über von der Rauigkeit abhängige Zunahmen von Zelldifferenzierung und Anheftung berichten [14, 34, 37, 59].

Während des gesamten Untersuchungszeitraums ergaben sich für die Zellzahlen unter statischen Bedingungen weder werkstoffabhängige noch von der Struktur der Oberfläche abhängige signifikante Unterschiede.

Im Gegensatz dazu zeigten Osteoblasten, die in Bewegung kultiviert wurden, einen signifikant (p < 0,01) stärkeren Rückgang auf glatten Oberflächen während der ersten zwei Tage der Kultivierung, offenbar, weil die geringere Zahl von Zellausläufern die Zellanheftung auf diesen Oberflächen verminderte. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen Y-TZP- und Titan-Oberflächen mit vergleichbaren Rauigkeiten. Nach dem dritten und vierten Tag wurden die höchsten Zellzahlen auf der Oberfläche von ZrO2 g gefunden. Mit Verfahren zur Anfärbung konnten Kollagensekretion und ALP-Aktivität nach 48 Stunden nur auf rauen Oberflächen festgestellt werden (Ti g+e, ZrO2 g).

Das lässt den Schluss zu, dass die In-vitro-Zellantwort insbesondere hinsichtlich Zellanheftung und Differenzierung auf Y-TZP-Oberflächen durch solche durchschnittlichen Oberflächen-Rauigkeitswerte positiv beeinflusst werden kann, die als ideal für Titan-Oberflächen definiert wurden [34, 59].

Dennoch werden nur kontrollierte klinische Studien in der Lage sein, Y-TZP als erfolgreiches Implantatmaterial
zu etablieren. Neben der Gestaltung der Oberfläche werden andere biomechanische Faktoren für Zirkoniumdioxid sorgfältiger Untersuchung bedürfen, so etwa der Abbau bei niedrigen Temperaturen, beschleunigte Alterung in feuchter Umgebung oder die Auswirkungen intraoralen Beschleifens [8, 13, 26, 29, 56].

Bislang liegen keine evidenten kontrollierten klinischen Ergebnisse über Y-TZP Implantate vor. Bis heute wurden vor allem Fallberichte oder Studien geringen Evidenzgrads veröffentlicht [9, 10, 22, 31, 36, 38]. Erst zukünftige kontrollierte klinische Daten werden weisen müssen, ob Zirkoniumdioxid als zuverlässiger Implantat-Werkstoff vorhersagbar eingesetzt werden kann.

Schlussfolgerungen

Oberflächenrauigkeit von Zirkoniumdioxid erscheint in-Vitro von ähnlicher großer Bedeutung für initiales Zellwachstum und Stoffwechsel zu sein, wie dies für Oberflächen von Titan-implantaten gezeigt wurde.

Danksagungen

Dr. Sandra Mittendrein, Christine Daxböck, Elisabeth Bock und Rudolf Schmied für ihre Beiträge zu diesem Manuskript.

Korrespondenzadresse:

Univ.-Prof. Dr. Martin Lorenzoni

Department of Prosthodontics

School of Dentistry, Medical University of Graz

Klinische Abteilung für Zahnersatzkunde

Universitätsklinik für Zahn-, Mund- u. Kieferheilkunde

Medizinische Universität Graz

Auenbruggerplatz 12, A-8036 Graz

Tel.: +43 (0)3 16 / 385-12976

Fax: +43 (0)3 16 / 385-16858

E-Mail: martin.lorenzoni@medunigraz.at

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Fussnoten

1 PD, Department f. Zahnärztliche Chirurgie und Röntgenologie, Universitätsklinik für Zahn-, Mund- u. Kieferheilkunde, Medizinische Universität Graz, Österreich; Auenbruggerplatz 12, A-8036 Graz, Österreich

2 Außerordentlicher Professor, Klinische Abteilung für Zahnersatzkunde, Universitätsklinik für Zahn-, Mund- u. Kieferheilkunde, Medizinische Universität Graz, Österreich; Auenbruggerplatz 12, A-8036 Graz, Österreich

3 Professor und Leiter des Departments f. Zahnärztliche Chirurgie und Röntgenologie, Universitätsklinik für Zahn-, Mund- u. Kieferheilkunde, Medizinische Universität Graz, Österreich; Auenbruggerplatz 12, A-8036 Graz, Österreich

4 Oberarzt, Department f. Zahnärztliche Chirurgie und Röntgenologie, Universitätsklinik für Zahn-, Mund- u. Kieferheilkunde, Medizinische Universität Graz, Österreich; Auenbruggerplatz 12, A-8036 Graz, Österreich

5 Professor und Vorstand am Institut für Zellbiologie, Histologie und Embryologie, Zentrum für Molekularmedizin, Medizinische Universität Graz, Österreich; Harrachgasse 21, A-8010 Graz, Österreich

6 Assistenzärztin, Klinische Abteilung für Zahnersatzkunde, Universitätsklinik für Zahn-, Mund- u. Kieferheilkunde, Medizinische Universität Graz, Österreich; Auenbruggerplatz 12, A-8036 Graz, Österreich

7 Außerordentlicher Professor, Department f. Zahnärztliche Chirurgie und Röntgenologie, Zahnmedizinische Universitätsklinik für Zahn-, Mund- u. Kieferheilkunde, Medizinische Universität Graz, Österreich


(Stand: 21.03.2011)

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